Mevcut protokol, OCT görüntüleme ve optogenetik kalp pacing için kalpte eNpHR2.0 veya ReaChR opsinlerini eksprese eden Drosophila melanogaster’in oluşumunu tanımlamaktadır. Farklı gelişim aşamalarında canlı hayvanlarda restore edilebilir kalp durması, bradikardi ve taşikardi simülasyonu da dahil olmak üzere Drosophila OCT görüntüleme ve kalp atışı modülasyonu için ayrıntılı talimatlar bildirilmiştir.
Drosophila melanogaster’nin (meyve sineği) model organizma olarak kullanılması, hücresel organizasyon ve genomik araştırmalardan davranışsal çalışmalara kadar biyoloji biliminin birçok alanında önemli ilerlemeler sağlamıştır. Biriken bilimsel bilgi birikimi nedeniyle, son yıllarda, Drosophila, kalp rahatsızlıkları da dahil olmak üzere insan hastalıklarının modellenmesi alanına getirildi. Sunulan çalışma, kırmızı ışık (617 nm) kullanan ve invaziv prosedürler olmadan bütün bir canlı organizma bağlamında kalp fonksiyonunu izlemek ve manipüle etmek için deneysel sistemi açıklamaktadır. Optogenetik araçlar kullanılarak kalp üzerinde kontrol sağlandı. Optogenetik, ışığa duyarlı transgenik opsinlerin ekspresyonunu ve ilgilenilen biyolojik dokuyu düzenlemek için optik aktivasyonlarını birleştirir. Bu çalışmada, 3. instar larva ve erken pupa gelişim evrelerinde işleyen D. melanogaster kalbini görselleştirmek ve modüle etmek için özel entegre optik koherens tomografi (OCT) görüntüleme ve optogenetik stimülasyon sistemi kullanılmıştır. UAS / GAL4 ikili genetik sistemi, özellikle sinek kalbinde, halorhodopsin (eNpHR2.0) ve kırmızıya kaymış kanalrodopsini (ReaChR) eksprese etmek için kullanıldı. D. melanogaster’in canlı OCT görüntüleme ve optogenetik pacing için hazırlanması ile ilgili ayrıntılar verilmiştir. Laboratuvar tarafından geliştirilen bir entegrasyon yazılımı, Drosophila kalp fonksiyonunun görsel sunumlarını ve nicel özelliklerini oluşturmak için görüntüleme verilerini işledi. Sonuçlar, eNpHR2.0 aktivasyonunun neden olduğu kalp durması ve bradikardi başlatmanın ve ReaChR aktivasyonu üzerine kalp pacing yapmanın fizibilitesini göstermektedir.
2010 yılının sonunda, Nature Methods dergisi optogenetiğiYılın Yöntemi 1 olarak seçti. İlgilenilen biyolojik dokuları benzeri görülmemiş bir hassasiyet ve hızla kontrol etmek için ışıkla düzenlenen genetik araçların (transgenik opsinler) kullanılması, yeni uygulamalar için bir sel kapısı açtı. Bugüne kadar, başarıların çoğu sinirbilime aittir. Teknoloji, tek nöronların hassas kontrolü için yeni bir yöntem olarak tanıtıldı2 ve canlı organizma bilişsel işlevleri alanındaki keşiflereilerledi 3. En başından beri, sinirbilimciler tüm organizmanın davranışını modüle etme yeteneğini gösterdiler. Farelerde dopaminerjik nöronlarda ChR2 opsin’in ekspresyonu ve ışık aktivasyonu aktivasyonlarına neden oldu ve davranışsal koşullanmayı sürdürmek için yeterliydi4. Kemirgen beyninin epileptik odağına verilen halorhodopsin NpHR2.0 içeren nöronların bir alt kümesinin optogenetik inhibisyonu elektroensefalografik nöbetlerin zayıflamasına neden olmuştur5.
Kardiyolojide optogenetik uygulamalar istikrarlı bir hızla gelişmektedir6. ChR2, kardiyomiyositler hücre kültüründe ve farelerde başarıyla eksprese edildi; kalp hızı, mavi ışığın yanıp sönmesiyle gerçekleştirildi (canlı hayvanlarda implante edilmiş bir lif kullanılarak gerçekleştirildi)7. Zebra balığında, ChR2 eksprese edildi ve hız yapan kalp bölgesini tanımlamak için kullanıldı; NpHR aktivasyonuna bağlı kalp durması8. Optogenetik kardiyak pacing, yeni pacing ve resenkronizasyon tedavileri geliştirmek için eşsiz bir potansiyele sahiptir9. Son zamanlarda otojen aritmi sonlandırma sistemi kurma girişimleri de bildirilmiştir10.
Kapsamlı araştırmalar ve yeni terapötik tedavilerin geliştirilmesi, hücre kültüründen memelilere kadar çeşitli model sistemlerin uygulanmasını gerektirir. Bir omurgalının kalbi çok karmaşık bir organdır. Kardiyomiyositler (CM) tüm kalp hücrelerinin üçte birini oluşturur; diğer hücreler arasında nöronlar, vasküler düz kas hücreleri ve uyarılamayan hücreler (yani, endotel hücreleri, fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri) bulunur. CM hücre kültürünün araştırılması, elde edilen sonuçların insan tıbbi uygulamalarına çevrilmesini sınırlar. Memeli model organizmaların genetik manipülasyonları sınırlıdır ve zaman alıcıdır. Daha küçük omurgasız modellerin birçok avantajı vardır; kardiyovasküler sistemleri tüm gerekli histolojik unsurları taşır. Drosophila melanogaster (meyve sineği), kalp hastalıkları da dahil olmak üzere insan hastalıklarıyla ilişkili genlerin rolünü araştırmak için basit ve güçlü bir genetik model sistemidir11,12,13. Kısa ömürlü hayvanlar olarak, meyve sinekleri yaşam boyunca izlenebilen yaşa veya hastalığa bağlı kardiyak fonksiyon değişikliklerini modellemek için mükemmel bir fırsatı temsil eder14,15,16,17. Meyve sineğinin kalp tüpü, vücudunun sırt tarafında, kütikül yüzeyinin 200 μm içinde bulunur ve yakın kızılötesi ışığın kalp tüpüne ulaşmasına izin verir. Bu anatomik özellik, mevcut optogenetik araçları kullanarak Drosophila kalbinin invaziv olmayan optik temposunu sağlar.
Drosophila kalbini izlemek için, entegre kırmızı ışık LED uyarma modülüne sahip özel bir spektral-alan optik koherens tomografi (SD-OCT) görüntüleme sistemi geliştirilmiştir18. Nispeten basit bir meyve sineği kalbindeki morfolojik ve ritmik değişiklikler, bu non-invaziv biyomedikal görüntüleme teknolojisi ile kolayca analiz edilebilir 12,19,20,21. Gelişmiş optik kesitleme performansı ve mikron ölçeğinde uzamsal çözünürlük ile OCT, Drosophila kalbinin yapısını araştırmak ve 3. instar larva ve erken pupa18 dahil olmak üzere farklı gelişim aşamalarındaki işlevini izlemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu sistem aynı zamanda Drosophila’nın bozulmamış hayvandaki kalp durumunun eşzamanlı olarak izlenmesini ve uyarılmasını sağlar. OCT sisteminin şematik görünümü Şekil 1’de gösterilmiştir. SD-OCT sistemi, ışık kaynağı olarak bir süperlüminesan diyot (SLD) kullanır (merkez dalga boyu: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, bakınız Malzeme Tablosu). 10x objektif lens kullanarak, OCT görüntüleme sistemi havada ~ 4.4 μm ve dokuda ~ 3.3 μm’lik bir eksenel çözünürlük ve ~ 2.8 μm’lik bir yanal çözünürlük elde edebilir, bu da sinek kalp yapılarının ince ayrıntılarını çözmek için yeterlidir18,22. Referans kolundan ve örnek koldan yansıyan ışığın parazit sinyalleri, 2048 piksel çizgi tarama kameralı bir spektrometre kullanılarak algılanır (maksimum çizgi hızı: 80 kHz, bkz. Ölçülen sistem hassasiyeti ~ 95.1 dB’dir. Her B modu OCT taraması, xz görüntü düzleminde kesitsel bir görüntü oluşturur. Tekrarlanan B modu görüntüleri, ~ 30 s 18,22,23’ün üzerinde atan kalbi yakalayan M modu görüntüleri oluşturmak için aynı yerde elde edilir. M modu görüntüleme için kare hızı, meyve sineği kalp atış dinamiklerini yakalamak için yeterli olan ~ 125 kare / s’dir.
Drosophila kalp fonksiyonunun optogenetik regülasyonu için, 617 nm LED ışık kaynağına sahip bir aydınlatma modülü, SD-OCT sisteminin örnek koluna entegre edilmiştir. Stimülasyon ışığı, numune yüzeyindeki ~ 2,2 mm çapında bir noktaya, görüntüleme odak noktasıyla aynı konumda odaklanır. Aydınlatma modunu (ışık yoğunluğu, darbe genişliği ve görev döngüsü) kontrol etmek, ışık darbesi stimülasyon frekansını ayarlamak ve LED modül aydınlatmasını ve M modu OCT görüntüleme alımını senkronize etmek için özel olarak yazılmış bir yazılım kullanılır22.
Son yayınlar, UAS / GAL4 genetik sistemini kullanarak mekansal olarak düzenlenmiş ChR2, ReaChR ve eNpHR2.0 opsinlerinden oluşan Drosophila transgenik sistemini tanımladı. Elde edilen sonuçlar, eNpHR2.0’ın kırmızı ışık aktivasyonunun neden olduğu kalp durması ve bradikardi ve ChR2’nin mavi ışık aktivasyonunun neden olduğu daha yüksek frekanslı kalp temposunu başlatma yeteneğini göstermiştir. Benzer pacing deneyleri, kırmızı ışık aydınlatması22,23,24 ile indüklenebilen başka bir channelrhodopsin olan ReaChR ile gerçekleştirildi. Tarif edilen tüm deneylerdeki opsin ekspresyonu, opsin ekspresyonunun kardiyomiyositler ve çevresindeki kas hücreleri de dahil olmak üzere çok çeşitli dokularda gözlendiği 24B-GAL4 tarafından yönlendirildi. Bu çalışmada, kalbe özgü eNpHR2.0 ve ReaChR opsins ekspresyonunu elde etmek için 24B-GAL4 bir Hand-GAL4 sürücüsü ile değiştirildi.
Genel olarak, sunulan deneysel sonuçlar restore edilebilir kalp durması ve indüklenebilir bradikardi ve taşikardi kalp rahatsızlıklarını göstermektedir. Transgenik Drosophila modelleri oluşturma ve canlı hayvanlarda eşzamanlı OCT görüntüleme ve optogenetik pacing deneyleri yapma konusunda adım adım talimatlar içeren ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.
Opsinlerin ekspresyonunun sadece kalpte değil, aynı zamanda çevredeki kas dokularında da sürüldüğü önceki raporlarımızla karşılaştırıldığında, mevcut çalışma kalbe özgü bir sürücü olan Hand-GAL4 kullanılarak rapor edilmektedir. Optogenetik kalp regülasyonu için kullanılan bu yeni El > opsin genetik konfigürasyonu, daha önce bildirilen sonuçları doğrular ve daha iyi bir Drosophila kardiyovasküler araştırma modeli oluşturur.
Medya hazırlığı, deneylerin başarısı için esastır. Opsin proteinleri,28’in çalışması için bir ligand, all-trans retinal (ATR) gerektirir. Sinekler yeterli ATR üretmez, bu nedenle ATR’nin sinek ortamına eklenmesi gerekir. Bu çalışmada, daha önce bildirilen hazır gıda, Yarı Tanımlı medya29 ile değiştirilmiştir. ATR’nin eşit bir şekilde dağıtılmasını sağlamak için ATR içeren ortamın yeni tarifi tanıtıldı. ATR suda çözünmez; su bazlı ortama etanol bazlı 100 mM ATR stoğu eklendiğinde, sıcak Yarı Tanımlı ortam içeren şişelerin vorteklenmesiyle dağılır. Ayrıca, daha önce bildirilen ATR konsantrasyonu, eNpHR2.0 için 10 mM’den ve ReaChR22 için 3 mM’den her ikisi için de 1 mM’lik bir nihai konsantrasyona düşürüldü. Bu konsantrasyon, uygun eNpHR2.0 ve ReaChR fonksiyonunu sağlamak için yeterlidir.
Deneysel başarının hayati bir bileşeni, FlyNet 2.027 ile geliştirilmiş veri işlemedir. Laboratuvar, otomatik sinek kalp segmentasyon algoritmasının hem hesaplama verimliliğini hem de doğruluğunu artırmak için bu yazılımı geliştirmeye devam etti. Bu yazılım tarafından üretilen kesitsel maskeler, fraksiyonel kısalma ve kalp duvarı hızı gibi Drosophila fizyolojik verilerini elde etmek için kullanılır. Bu yaklaşım, minimum insan gözetimi ile verimli veri analizini mümkün kılarak büyük sinek kalp görüntüleme veri kümeleri için kalp fonksiyonunu karakterize etmeyi daha hızlı ve daha güvenilir hale getirmiştir.
Miyokard enfarktüsü önde gelen ölüm nedeni olmaya devam etmektedir ve miyokard iskemisi, Amerika Birleşik Devletleri’nde önde gelen mortalite ve morbidite nedenleri arasında hızla ortaya çıkan tüm kalp yetmezliği vakalarının üçte ikisine katkıda bulunmaktadır30. Yeni terapötiklerin ve tıbbi cihazların geliştirilmesi, kalp hastalıklarının fizyolojik ve biyokimyasal düzeylerdeki mekanizmaları hakkında derin bilgi gerektirir. Bu hedeflere model organizmaların yardımıyla ulaşılabilir. D. melanogaster, en güvenilir ve verimli modellerden biri olarak kendini kanıtlamıştır 31,32,33,34,35. Bu çalışma, invaziv olmayan bir optogenetik yaklaşımın neden olduğu simüle edilmiş Drosophila kalp bozuklukları modellerini üretti. Non-invaziv optik kalp pacing teknolojilerinin geliştirilmesi, geleneksel elektrikli kalp pacing cihazlarına bir alternatif geliştirmek için bir temel oluşturmaktadır. Kalp fonksiyonunu gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için OCT’nin kullanılması, çalışmaların ilaç adayı taraması da dahil olmak üzere ileri araştırmalar için Drosophila modellerinde ilgili kalp fizyolojisini doğru bir şekilde karakterize etmesini sağlar. OCT görüntüleme, Drosophila kalp çalışmaları için iyi çalışan, ancak daha büyük hayvan modellerinde kalp fonksiyonunu karakterize etmek için kullanımını sınırlayan ~ 1 mm’lik bir penetrasyon derinliğine sahiptir. Ayrıca, Drosophila araştırmasını doğrudan memeli modellerine çevirmek bir meydan okumayı temsil ediyor. Kardiyovasküler araştırmalar için opsinlerin hassasiyetini artırmak ve bunları zebra balığı, fareler, sıçanlar ve insan kalp organoidleri de dahil olmak üzere çeşitli model sistemlere çevirmek için yeni optogenetik araçların geliştirilmesi gerekmektedir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Andrey Komarov, Yuxuan Wang ve Jiantao Zhu’ya veri analizindeki yardımları için teşekkür ediyor ve değerli tartışmaları için Zhou laboratuvar üyelerine teşekkür ediyor. Dr. Zhou’nun laboratuvarındaki çalışmalar, St. Louis’deki Washington Üniversitesi’nden bir başlangıç fonu, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01-EB025209 ve R01-HL156265 ve Clayco Vakfı Yenilikçi Araştırma Ödülü ile desteklendi.
All-trans retinal | Cayman Chemicals | 18449 | |
Bacto Peptone | Gibco | 02-10-2025 | |
BioLED Light Source Control Module, 4-channel | Migtex Systems | BLS-SA04-US | Part of the optogenetic stimulation module |
Broadband Light Source Module | Superlum | cBLMD-T-850-HP | Part of the SD-OCT imaging system |
Cobra-S 800 OCT Spectrometers | Wasatch Photonics | CS800-840/180-80-OC2K-U3 | Part of the SD-OCT imaging system |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professtional | 34155 | tissues |
Drosophila agar | Genesee Scientific | 66-103 | |
Drosophila culture bottles | Genesee Scientific | 32-131 | |
FlyNet 2.0 Software | Z-Lab | Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab | |
High-Power LED Collimator Sources | Migtex Systems | BLS-LCS-0617-03-22 | Part of the optogenetic stimulation module |
Inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-106 | |
Microscope slides | AmScope | BS-72P | |
Narrow plugs for Drosophila culture | Genesee Scientific | 59-200 | |
Narrow vials for Drosophila culture | Genesee Scientific | 32-116SB | |
Permanent double-sided tape | Scotch | ||
Plugs for Drosophila bottles | Genesee Scientific | 59-194 | |
Propionic Acid | Sigma | P1386-1L | |
SD-OCT control software | Z-Lab | Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab | |
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system | Z-Lab | Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM) | |
Sucrose | Carolina | 89-2871 | |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 41752 | eNpHR2.0 transgenic line |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 53748 | ReaChR transgenic line |
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 48396 | Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment |
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock #6658 | GFP reporter line |
Yeast extract | Lab Scientific bioKEMIX | 978-907-4243 |