Il presente protocollo descrive la generazione di Drosophila melanogaster che esprime le opsine eNpHR2.0 o ReaChR nel cuore per l’imaging OCT e la stimolazione cardiaca optogenetica. Sono riportate istruzioni dettagliate per l’imaging OCT di Drosophila e la modulazione del battito cardiaco, compresa la simulazione di arresto cardiaco ripristinabile, bradicardia e tachicardia in animali vivi in diversi stadi di sviluppo.
L’utilizzo di Drosophila melanogaster (moscerino della frutta) come organismo modello ha assicurato progressi significativi in molte aree della scienza biologica, dall’organizzazione cellulare e dalle indagini genomiche agli studi comportamentali. A causa delle conoscenze scientifiche accumulate, negli ultimi anni, la Drosophila è stata portata nel campo della modellazione delle malattie umane, compresi i disturbi cardiaci. Il lavoro presentato descrive il sistema sperimentale per il monitoraggio e la manipolazione della funzione cardiaca nel contesto di un intero organismo vivo utilizzando la luce rossa (617 nm) e senza procedure invasive. Il controllo sul cuore è stato ottenuto utilizzando strumenti optogenetici . L’optogenetica combina l’espressione di opsine transgeniche sensibili alla luce e la loro attivazione ottica per regolare il tessuto biologico di interesse. In questo lavoro, è stato utilizzato un sistema personalizzato di tomografia a coerenza ottica integrata (OCT) e di stimolazione optogenetica per visualizzare e modulare il funzionamento del cuore di D. melanogaster al 3 ° stadio di sviluppo larvale e precoce della pupa. Il doppio sistema genetico UAS/GAL4 è stato impiegato per esprimere halorhodopsina (eNpHR2.0) e channelrhodopsin (ReaChR), in particolare nel cuore di mosca. Vengono forniti dettagli sulla preparazione di D. melanogaster per l’imaging OCT vivo e la stimolazione optogenetica. Un software di integrazione sviluppato in laboratorio ha elaborato i dati di imaging per creare presentazioni visive e caratteristiche quantitative della funzione cardiaca della Drosophila . I risultati dimostrano la fattibilità di iniziare l’arresto cardiaco e la bradicardia causati dall’attivazione di eNpHR2.0 e di eseguire la stimolazione cardiaca all’attivazione di ReaChR.
Alla fine del 2010, la rivista Nature Methods ha selezionato l’optogenetica come Metodo dell’Anno1. L’utilizzo di strumenti genetici (opsine transgeniche) regolate dalla luce per controllare i tessuti biologici di interesse con precisione e velocità senza precedenti ha aperto una porta a nuove applicazioni. Ad oggi, la maggior parte dei risultati appartiene alle neuroscienze. La tecnologia è stata introdotta come un nuovo metodo di controllo preciso dei singoli neuroni2 ed è avanzata alle scoperte nell’area delle funzioni cognitive dell’organismo vivo3. Fin dall’inizio, i neuroscienziati hanno dimostrato la capacità di modulare il comportamento dell’intero organismo. L’espressione e l’attivazione della luce dell’opsina ChR2 nei topi neuroni dopaminergici hanno causato la loro attivazione e sono stati sufficienti a guidare il condizionamento comportamentale4. L’inibizione optogenetica di un sottogruppo di neuroni contenenti halorhodopsin NpHR2.0 consegnati al focolaio epilettico del cervello dei roditori ha determinato l’attenuazione delle crisi elettroencefalografiche5.
Le applicazioni optogenetiche in cardiologia si stanno sviluppando a un ritmo costante6. ChR2 è stato espresso con successo in colture cellulari di cardiomiociti e nei topi; La stimolazione cardiaca è stata condotta mediante lampi di luce blu (eseguiti utilizzando una fibra impiantata in animali vivi)7. Nel pesce zebra, ChR2 è stato espresso e utilizzato per identificare la regione cardiaca che fa il passo; L’attivazione di NpHR ha indotto l’arresto cardiaco8. Il pacing cardiaco optogenetico ha il potenziale unico per lo sviluppo di nuove terapie di stimolazione e risincronizzazione9. Recentemente sono stati segnalati anche tentativi di stabilire un sistema di terminazione dell’aritmia autogena10.
La ricerca approfondita e lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici richiedono l’applicazione di vari sistemi modello, dalla coltura cellulare ai mammiferi. Il cuore di un vertebrato è un organo molto complesso. I cardiomiociti (CM) comprendono un terzo di tutte le cellule cardiache; Altre cellule includono neuroni, cellule muscolari lisce vascolari e cellule non eccitabili (cioè cellule endoteliali, fibroblasti e cellule immunitarie). La ricerca sulla coltura cellulare CM limita la traduzione dei risultati ottenuti in applicazioni mediche umane. Le manipolazioni genetiche degli organismi modello di mammiferi sono limitate e richiedono molto tempo. I modelli di invertebrati più piccoli hanno molti vantaggi; Il loro sistema cardiovascolare trasporta tutti gli elementi istologici essenziali. Drosophila melanogaster (moscerino della frutta) è un sistema modello genetico semplice e potente per studiare il ruolo dei geni associati alle malattie umane, comprese le malattie cardiache11,12,13. Come animali di breve durata, i moscerini della frutta rappresentano un’eccellente opportunità per modellare i cambiamenti della funzione cardiaca dipendenti dall’età o dalla malattia che possono essere rintracciati per tutta la vita14,15,16,17. Il tubo cardiaco del moscerino della frutta si trova sul lato dorsale del suo corpo entro 200 μm dalla superficie della cuticola, consentendo alla luce visibile al vicino infrarosso di raggiungere il tubo cardiaco. Questa caratteristica anatomica consente la stimolazione ottica non invasiva del cuore di Drosophila utilizzando strumenti optogenetici esistenti.
Per monitorare il cuore di Drosophila, è stato sviluppato un sistema di imaging personalizzato per la tomografia a coerenza ottica (SD-OCT) con un modulo di eccitazione LED a luce rossa integrato18. I cambiamenti morfologici e ritmici in un cuore di moscerino della frutta relativamente semplice possono essere facilmente analizzati con questa tecnologia di imaging biomedico non invasiva 12,19,20,21. Con prestazioni di sezionamento ottico migliorate e risoluzione spaziale su scala micron, OCT è stato utilizzato con successo per studiare la struttura e monitorare la funzione del cuore di Drosophila in diversi stadi di sviluppo, tra cui la larva 3rd instar e la pupa18 precoce. Questo sistema consente inoltre il monitoraggio simultaneo e la stimolazione delle condizioni cardiache della Drosofila nell’animale intatto. Una vista schematica del sistema dello Strumento di personalizzazione di Office è illustrata nella Figura 1. Il sistema SD-OCT utilizza un diodo superluminescente (SLD) come sorgente luminosa (lunghezza d’onda centrale: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, vedi Tabella dei materiali). Utilizzando una lente obiettivo 10x, il sistema di imaging OCT può raggiungere una risoluzione assiale di ~4,4 μm in aria e ~3,3 μm in tessuto e una risoluzione laterale di ~2,8 μm, sufficiente per risolvere i dettagli fini delle strutture cardiache della mosca 18,22. I segnali di interferenza della luce riflessa dal braccio di riferimento e dal braccio campione vengono rilevati utilizzando uno spettrometro con una telecamera a scansione lineare da 2048 pixel (velocità massima di linea: 80 kHz, vedere Tabella dei materiali). La sensibilità del sistema misurata è ~ 95,1 dB. Ogni scansione dello Strumento di personalizzazione di Office in modalità B genera un’immagine in sezione trasversale nel piano dell’immagine xz. Le immagini ripetute in modalità B vengono acquisite nella stessa posizione per creare immagini in modalità M che catturano il cuore pulsante per oltre ~ 30 s 18,22,23. Il frame rate per l’imaging M-mode è ~ 125 fotogrammi / s, sufficiente per catturare le dinamiche del battito del cuore del moscerino della frutta.
Per la regolazione optogenetica della funzione cardiaca della Drosophila , un modulo di illuminazione con una sorgente luminosa a LED da 617 nm è integrato con il braccio campione del sistema SD-OCT. La luce di stimolazione è focalizzata su un punto di ~ 2,2 mm di diametro sulla superficie del campione, nella stessa posizione del punto di messa a fuoco dell’imaging. Un software personalizzato viene utilizzato per controllare la modalità di illuminazione (intensità della luce, larghezza dell’impulso e duty cycle), regolare la frequenza di stimolazione dell’impulso luminoso e sincronizzare l’illuminazione del modulo LED e l’acquisizione dell’imaging OCT M-mode22.
Recenti pubblicazioni hanno descritto il sistema transgenico Drosophila costituito da opsine ChR2, ReaChR ed eNpHR2.0 regolate spaziotemporalmente utilizzando il sistema genetico UAS / GAL4. I risultati ottenuti hanno dimostrato la capacità di iniziare l’arresto cardiaco e la bradicardia causati dall’attivazione della luce rossa di eNpHR2.0 e la stimolazione cardiaca ad alta frequenza causata dall’attivazione della luce blu di ChR2. Esperimenti di stimolazione simili sono stati eseguiti con un’altra channelrhodopsin, ReaChR, inducibile dall’illuminazione a luce rossa22,23,24. L’espressione di opsina in tutti gli esperimenti descritti è stata guidata da 24B-GAL4, dove l’espressione di opsina è stata osservata in una vasta gamma di tessuti, inclusi cardiomiociti e cellule muscolari circostanti. Nel presente studio, 24B-GAL4 è stato sostituito da un driver Hand-GAL4 per ottenere l’espressione delle opsine eNpHR2.0 e ReaChR specifiche per il cuore.
Nel complesso, i risultati sperimentali presentati dimostrano arresto cardiaco ripristinabile e condizioni cardiache inducibili di bradicardia e tachicardia. Viene fornito un protocollo dettagliato con istruzioni dettagliate sulla creazione di modelli transgenici di Drosophila e sulla conduzione simultanea di esperimenti di imaging OCT e stimolazione optogenetica in animali vivi.
Rispetto ai nostri precedenti rapporti in cui l’espressione di opsine era guidata non solo nel cuore ma anche nei tessuti muscolari circostanti, il presente lavoro riferisce utilizzando un driver specifico per il cuore, Hand-GAL4. Questa nuova configurazione genetica dell’opsina Hand> utilizzata per la regolazione del cuore optogenetica conferma ulteriormente i risultati precedentemente riportati e stabilisce un migliore modello di ricerca cardiovascolare sulla Drosophila .
La preparazione dei media è essenziale per il successo degli esperimenti. Le proteine Opsin richiedono un ligando, all-trans retinico (ATR), per funzionare28. Le mosche non producono abbastanza ATR, quindi ATR deve essere integrato al mezzo di mosca. In questo studio, il cibo istantaneo precedentemente riportato è stato sostituito con mezzi semidefiniti29. La nuova ricetta dei supporti contenenti ATR è stata introdotta per garantire una distribuzione uniforme di ATR. ATR non è solubile in acqua; quando lo stock di ATR da 100 mM a base di etanolo viene aggiunto ai mezzi a base d’acqua, viene disperso vorticando le fiale contenenti mezzi semidefiniti caldi. Inoltre, la concentrazione di ATR precedentemente riportata è stata ridotta da 10 mM per eNpHR2.0 e 3 mM per ReaChR22 a una concentrazione finale di 1 mM per entrambi. Questa concentrazione è sufficiente per garantire il corretto funzionamento di eNpHR2.0 e ReaChR.
Una componente vitale del successo sperimentale è la migliore elaborazione dei dati con FlyNet 2.027. Il laboratorio ha continuato a sviluppare questo software per migliorare sia l’efficienza computazionale che l’accuratezza dell’algoritmo automatizzato di segmentazione del cuore di mosca. Le maschere in sezione trasversale prodotte da questo software vengono utilizzate per ricavare dati fisiologici di Drosophila come l’accorciamento frazionario e la velocità della parete cardiaca. Questo approccio ha consentito un’analisi efficiente dei dati con una supervisione umana minima, rendendo più rapida e affidabile la caratterizzazione della funzione cardiaca per grandi set di dati di imaging del cuore di mosca.
L’infarto miocardico rimane la principale causa di morte e l’ischemia miocardica contribuisce a due terzi di tutti i casi di insufficienza cardiaca, che sta rapidamente emergendo tra le principali cause di mortalità e morbilità negli Stati Uniti30. Lo sviluppo di nuove terapie e dispositivi medici richiede una profonda conoscenza dei meccanismi dei disturbi cardiaci a livello fisiologico e biochimico. Questi obiettivi possono essere raggiunti con l’aiuto di organismi modello. D. melanogaster si è affermato come uno dei modelli più affidabili ed efficienti 31,32,33,34,35. Questo lavoro ha generato i modelli simulati di disturbi cardiaci della Drosophila indotti da un approccio optogenetico non invasivo. Lo sviluppo di tecnologie di stimolazione cardiaca ottica non invasive fornisce una base per lo sviluppo di un’alternativa ai tradizionali dispositivi elettrici di stimolazione cardiaca. L’utilizzo dell’OCT per osservare la funzione cardiaca in tempo reale consente agli studi di caratterizzare accuratamente la fisiologia cardiaca pertinente nei modelli di Drosophila per indagini avanzate, incluso lo screening dei farmaci candidati. L’imaging OCT ha una profondità di penetrazione di ~ 1 mm, che funziona bene per gli studi sul cuore di Drosophila, ma ne limita l’uso per caratterizzare la funzione cardiaca in modelli animali più grandi. Inoltre, tradurre direttamente la ricerca sulla Drosophila in modelli di mammiferi rappresenta una sfida. Nuovi strumenti optogenetici devono essere sviluppati per migliorare la sensibilità delle opsine e tradurli in vari sistemi modello, tra cui zebrafish, topi, ratti e organoidi cardiaci umani, per la ricerca cardiovascolare.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano Andrey Komarov, Yuxuan Wang e Jiantao Zhu per la loro assistenza nell’analisi dei dati e ringraziano i membri del laboratorio Zhou per le loro preziose discussioni. Il lavoro nel laboratorio del Dr. Zhou è stato sostenuto da un fondo iniziale della Washington University di St. Louis, dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) R01-EB025209 e R01-HL156265 e dal Clayco Foundation Innovative Research Award.
All-trans retinal | Cayman Chemicals | 18449 | |
Bacto Peptone | Gibco | 02-10-2025 | |
BioLED Light Source Control Module, 4-channel | Migtex Systems | BLS-SA04-US | Part of the optogenetic stimulation module |
Broadband Light Source Module | Superlum | cBLMD-T-850-HP | Part of the SD-OCT imaging system |
Cobra-S 800 OCT Spectrometers | Wasatch Photonics | CS800-840/180-80-OC2K-U3 | Part of the SD-OCT imaging system |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professtional | 34155 | tissues |
Drosophila agar | Genesee Scientific | 66-103 | |
Drosophila culture bottles | Genesee Scientific | 32-131 | |
FlyNet 2.0 Software | Z-Lab | Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab | |
High-Power LED Collimator Sources | Migtex Systems | BLS-LCS-0617-03-22 | Part of the optogenetic stimulation module |
Inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-106 | |
Microscope slides | AmScope | BS-72P | |
Narrow plugs for Drosophila culture | Genesee Scientific | 59-200 | |
Narrow vials for Drosophila culture | Genesee Scientific | 32-116SB | |
Permanent double-sided tape | Scotch | ||
Plugs for Drosophila bottles | Genesee Scientific | 59-194 | |
Propionic Acid | Sigma | P1386-1L | |
SD-OCT control software | Z-Lab | Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab | |
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system | Z-Lab | Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM) | |
Sucrose | Carolina | 89-2871 | |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 41752 | eNpHR2.0 transgenic line |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 53748 | ReaChR transgenic line |
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 48396 | Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment |
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock #6658 | GFP reporter line |
Yeast extract | Lab Scientific bioKEMIX | 978-907-4243 |