Настоящий протокол описывает генерацию Drosophila melanogaster , экспрессирующего eNpHR2.0 или ReaChR опсины в сердце для визуализации OCT и оптогенетической кардиостимуляции. Представлены подробные инструкции по визуализации Drosophila OCT и модуляции сердцебиения, включая моделирование восстановительной остановки сердца, брадикардии и тахикардии у живых животных на разных стадиях развития.
Использование Drosophila melanogaster (плодовая муха) в качестве модельного организма обеспечило значительный прогресс во многих областях биологической науки, от клеточной организации и геномных исследований до поведенческих исследований. Благодаря накопленным научным знаниям, в последние годы дрозофила была выведена в область моделирования заболеваний человека, в том числе сердечных заболеваний. В представленной работе описана экспериментальная система мониторинга и манипулирования функцией сердца в контексте всего живого организма с использованием красного света (617 нм) и без инвазивных процедур. Контроль над сердцем достигался с помощью оптогенетических средств. Оптогенетика сочетает в себе экспрессию светочувствительных трансгенных опсинов и их оптическую активацию для регулирования интересующей биологической ткани. В этой работе была использована специальная интегрированная оптическая когерентная томография (ОКТ) и система оптогенетической стимуляции для визуализации и модуляции функционирующего сердца D. melanogaster на 3-й стадии развития личинки звезды и ранней стадии развития куколки. Двойная генетическая система UAS/GAL4 использовалась для экспрессии галорходопсина (eNpHR2.0) и каналародопсина с красным смещением (ReaChR), особенно в сердце мухи. Приведены подробные сведения о подготовке D. melanogaster к визуализации OCT в реальном времени и оптогенетическому кардиостимуляции. Разработанное в лаборатории интеграционное программное обеспечение обрабатывало данные визуализации для создания визуальных представлений и количественных характеристик функции сердца дрозофилы . Результаты демонстрируют возможность инициирования остановки сердца и брадикардии, вызванных активацией eNpHR2.0, и выполнения кардиостимуляции при активации ReaChR.
В конце 2010 года журнал Nature Methods выбрал оптогенетику в качестве метода года1. Использование генетических инструментов (трансгенных опсинов), регулируемых светом, для контроля биологических тканей, представляющих интерес, с беспрецедентной точностью и скоростью открыло шлюз для новых применений. На сегодняшний день большинство достижений относятся к нейробиологии. Технология была внедрена как новый метод точного управления одиночными нейронами2 и продвинулась к открытиям в области когнитивных функций живого организма3. С самого начала нейробиологи продемонстрировали способность модулировать поведение всего организма. Экспрессия и легкая активация опсина ChR2 у дофаминергических нейронов мышей вызывали их активацию и были достаточными для управления поведенческим обусловливанием4. Оптогенетическое ингибирование подмножества нейронов, содержащих галорходопсин NpHR2.0, доставляемых в эпилептический очаг мозга грызунов, приводило к ослаблению электроэнцефалографических припадков5.
Оптогенетические приложения в кардиологии развиваются устойчивыми темпами6. ChR2 успешно экспрессировался в культуре клеток кардиомиоцитов и у мышей; кардиостимуляция проводилась вспышками синего света (выполнялась с использованием имплантированного волокна у живых животных)7. У рыбок данио ChR2 экспрессировался и использовался для идентификации области сердца, вызывающей темп; Активация NpHR индуцировала остановку сердца8. Оптогенетическая кардиостимуляция обладает уникальным потенциалом для разработки новых методов кардиостимуляции и ресинхронизирующейтерапии 9. Попытки установить систему прекращения аутогенной аритмии были зарегистрированы в последнее время, а также10.
Обширные исследования и разработка новых терапевтических методов лечения требуют применения различных модельных систем, от клеточной культуры до млекопитающих. Сердце позвоночных является очень сложным органом. Кардиомиоциты (КМ) составляют треть всех сердечных клеток; другие клетки включают нейроны, гладкомышечные клетки сосудов и невозбудимые клетки (то есть эндотелиальные клетки, фибробласты и иммунные клетки). Исследование клеточной культуры СМ ограничивает трансляцию полученных результатов в медицинские приложения человека. Генетические манипуляции модельных организмов млекопитающих ограничены и отнимают много времени. Меньшие модели беспозвоночных имеют много преимуществ; их сердечно-сосудистая система несет в себе все необходимые гистологические элементы. Drosophila melanogaster (плодовая муха) представляет собой простую и мощную генетическую модельную систему для исследования роли генов, связанных с заболеваниями человека, включая сердечные заболевания 11,12,13. Как недолговечные животные, плодовые мушки представляют собой прекрасную возможность для моделирования возрастных или зависимых от болезней изменений сердечной функции, которые можно проследить на протяжении всей жизни 14,15,16,17. Сердечная трубка плодовой мухи расположена на спинной стороне ее тела в пределах 200 мкм от поверхности кутикулы, что позволяет видимому ближнему инфракрасному свету достигать сердечной трубки. Эта анатомическая особенность позволяет неинвазивное оптическое измерение сердца дрозофилы с использованием существующих оптогенетических инструментов.
Для мониторинга сердца дрозофилы была разработана специальная спектрально-доменная оптическая когерентная томография (SD-OCT) с интегрированным модулем возбуждения светодиодного возбуждения красного света18. Морфологические и ритмические изменения в относительно простом сердце плодовой мухи могут быть легко проанализированы с помощью этой неинвазивной биомедицинской технологии визуализации 12,19,20,21. Благодаря улучшенной производительности оптического сечения и пространственному разрешению в микронном масштабе, OCT успешно используется для исследования структуры и мониторинга функции сердца дрозофилы на разных стадиях развития, включая 3-ю звездную личинку и раннюю куколку18. Эта система также позволяет одновременно контролировать и стимулировать сердечное состояние дрозофилы у интактного животного. Схематическое представление системы центр развертывания Office показано на рисунке 1. Система SD-OCT использует сверхлюминесцентный диод (SLD) в качестве источника света (центральная длина волны: 850 нм ± 10 нм, FWHM: 165 нм, см. Таблицу материалов). Используя объективную линзу 10x, система визуализации OCT может достичь осевого разрешения ~ 4,4 мкм в воздухе и ~ 3,3 мкм в ткани и бокового разрешения ~ 2,8 мкм, достаточного для разрешения мелких деталей структур сердца мухи18,22. Интерференционные сигналы отраженного света от опорного рычага и образца манипулятора обнаруживаются с помощью спектрометра с 2048-пиксельной линейной сканирующей камерой (максимальная скорость линии: 80 кГц, см. Таблицу материалов). Измеренная чувствительность системы составляет ~95,1 дБ. Каждое сканирование центра развертывания Office в B-режиме создает изображение поперечного сечения в плоскости изображения xz. Повторяющиеся изображения B-режима получаются в одном и том же месте для создания изображений M-режима, захватывающих бьющееся сердце более 30 с 18,22,23. Частота кадров для изображения в М-режиме составляет ~ 125 кадров / с, что достаточно для захвата динамики биения сердца плодовой мухи.
Для оптогенетической регуляции функции сердца дрозофилы модуль освещения со светодиодным источником света 617 нм интегрирован с образцовым рычагом системы SD-OCT. Стимулирующий свет фокусируется на точке диаметром ~ 2,2 мм на поверхности образца, в том же положении, что и точка фокусировки изображения. Специально написанное программное обеспечение используется для управления режимом освещения (интенсивность света, ширина импульса и рабочий цикл), регулировки частоты стимуляции светового импульса и синхронизации освещения светодиодного модуля и получения изображений OCT в М-режиме22.
В недавних публикациях описывалась трансгенная система Drosophila, состоящая из пространственно-височно регулируемых chR2, ReaChR и eNpHR2.0 опсинов с использованием генетической системы UAS/GAL4. Полученные результаты продемонстрировали способность инициировать остановку сердца и брадикардию, вызванную активацией красным светом eNpHR2.0 и более высокочастотной кардиостимуляцией, вызванной активацией синим светом ChR2. Аналогичные эксперименты были проведены с другим канальнымродопсином, ReaChR, индуцируемым освещением красным светом 22,23,24. Экспрессия опсина во всех описанных экспериментах была обусловлена 24B-GAL4, где экспрессия опсина наблюдалась в широком спектре тканей, включая кардиомиоциты и окружающие мышечные клетки. В текущем исследовании 24B-GAL4 был заменен драйвером Hand-GAL4 для достижения экспрессии опсинов eNpHR2.0 и ReaChR, специфичных для сердца.
В целом, представленные экспериментальные результаты демонстрируют восстановительную остановку сердца и индуцируемую брадикардию и тахикардию сердечных заболеваний. Приведен подробный протокол с пошаговыми инструкциями по созданию трансгенных моделей дрозофилы и проведению одновременной ОКТ-визуализации и экспериментов с оптогенетическим темпом у живых животных.
По сравнению с нашими предыдущими отчетами, где экспрессия опсинов была вызвана не только в сердце, но и в окружающих мышечных тканях, настоящая работа сообщает с использованием кардиоспецифического драйвера , Hand-GAL4. Эта новая генетическая конфигурация hand> opsin, используемая для оптогенетической регуляции сердца, еще раз подтверждает ранее сообщенные результаты и устанавливает лучшую модель сердечно-сосудистых исследований дрозофилы .
Подготовка сми имеет важное значение для успеха экспериментов. Белки опсина требуют лиганда, полностью транс-ретинального (ATR), чтобы функционировать28. Мухи не производят достаточно atr, поэтому ATR должен быть дополнен в среду полета. В этом исследовании ранее сообщенная пища быстрого приготовления была заменена полуопределенной средой29. Новая рецептура ATR-содержащих сред была введена для обеспечения равномерного распределения ATR. ATR не растворим в воде; когда запас ATR на основе этанола 100 мМ добавляется в среду на водной основе, он диспергируется путем вихря флаконов, содержащих теплые полуопределенные среды. Кроме того, ранее сообщенная концентрация ATR была снижена с 10 мМ для eNpHR2,0 и 3 мМ для ReaChR22 до конечной концентрации 1 мМ для обоих. Эта концентрация достаточна для обеспечения надлежащей функции eNpHR2.0 и ReaChR.
Жизненно важным компонентом экспериментального успеха является улучшенная обработка данных с помощью FlyNet 2.027. Лаборатория продолжает разрабатывать это программное обеспечение для повышения как вычислительной эффективности, так и точности автоматизированного алгоритма сегментации сердца мухи. Маски поперечного сечения, производимые этим программным обеспечением, используются для получения физиологических данных дрозофилы , таких как дробное укорочение и скорость сердечной стенки. Этот подход позволил эффективно анализировать данные с минимальным наблюдением человека, что позволяет быстрее и надежнее охарактеризовать функцию сердца для больших наборов данных визуализации сердца мух.
Инфаркт миокарда остается ведущей причиной смерти, а ишемия миокарда способствует двум третям всех случаев сердечной недостаточности, которая стремительно вырисовывается среди ведущих причин смертности и заболеваемости в США30. Разработка новых терапевтических средств и медицинских устройств требует глубоких знаний механизмов сердечных заболеваний на физиологическом и биохимическом уровнях. Эти цели могут быть достигнуты с помощью модельных организмов. D. melanogaster зарекомендовал себя как одна из самых надежных и эффективных моделей 31,32,33,34,35. Эта работа создала смоделированные модели сердечных расстройств дрозофилы, вызванные неинвазивным оптогенетическим подходом. Развитие неинвазивных оптических технологий кардиостимуляции обеспечивает основу для разработки альтернативы традиционным электрическим кардиостимуляторам. Использование OCT для наблюдения за функцией сердца в режиме реального времени позволяет исследованиям точно охарактеризовать соответствующую физиологию сердца в моделях дрозофилы для расширенных исследований, включая скрининг кандидатов на лекарства. OCT-визуализация имеет глубину проникновения ~ 1 мм, что хорошо работает для исследований сердца дрозофилы, но ограничивает ее использование для характеристики функции сердца на более крупных животных моделях. Кроме того, прямой перевод исследований дрозофилы на модели млекопитающих представляет собой проблему. Необходимо разработать новые оптогенетические инструменты для улучшения чувствительности к опсинам и перевода их в различные модельные системы, включая рыбок данио, мышей, крыс и органоидов сердца человека, для сердечно-сосудистых исследований.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Андрея Комарова, Юйсюань Вана и Цзяньтао Чжу за помощь в анализе данных и благодарят членов лаборатории Чжоу за их ценные дискуссии. Работа в лаборатории доктора Чжоу поддерживалась стартовым фондом Вашингтонского университета в Сент-Луисе, грантами Национального института здравоохранения (NIH) R01-EB025209 и R01-HL156265, а также премией Clayco Foundation Innovative Research Award.
All-trans retinal | Cayman Chemicals | 18449 | |
Bacto Peptone | Gibco | 02-10-2025 | |
BioLED Light Source Control Module, 4-channel | Migtex Systems | BLS-SA04-US | Part of the optogenetic stimulation module |
Broadband Light Source Module | Superlum | cBLMD-T-850-HP | Part of the SD-OCT imaging system |
Cobra-S 800 OCT Spectrometers | Wasatch Photonics | CS800-840/180-80-OC2K-U3 | Part of the SD-OCT imaging system |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professtional | 34155 | tissues |
Drosophila agar | Genesee Scientific | 66-103 | |
Drosophila culture bottles | Genesee Scientific | 32-131 | |
FlyNet 2.0 Software | Z-Lab | Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab | |
High-Power LED Collimator Sources | Migtex Systems | BLS-LCS-0617-03-22 | Part of the optogenetic stimulation module |
Inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-106 | |
Microscope slides | AmScope | BS-72P | |
Narrow plugs for Drosophila culture | Genesee Scientific | 59-200 | |
Narrow vials for Drosophila culture | Genesee Scientific | 32-116SB | |
Permanent double-sided tape | Scotch | ||
Plugs for Drosophila bottles | Genesee Scientific | 59-194 | |
Propionic Acid | Sigma | P1386-1L | |
SD-OCT control software | Z-Lab | Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab | |
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system | Z-Lab | Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM) | |
Sucrose | Carolina | 89-2871 | |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 41752 | eNpHR2.0 transgenic line |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 53748 | ReaChR transgenic line |
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 48396 | Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment |
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock #6658 | GFP reporter line |
Yeast extract | Lab Scientific bioKEMIX | 978-907-4243 |