Le présent protocole décrit la génération d’opsines de Drosophila melanogaster exprimant des opsines eNpHR2.0 ou ReaChR dans le cœur pour l’imagerie OCT et la stimulation cardiaque optogénétique. Des instructions détaillées pour l’imagerie de la TCO de la drosophile et la modulation des battements cardiaques, y compris la simulation d’un arrêt cardiaque réparable, d’une bradycardie et d’une tachycardie chez des animaux vivants à différents stades de développement, sont rapportées.
L’utilisation de Drosophila melanogaster (mouche des fruits) comme organisme modèle a permis des progrès significatifs dans de nombreux domaines de la science biologique, de l’organisation cellulaire et des enquêtes génomiques aux études comportementales. En raison des connaissances scientifiques accumulées, ces dernières années, la drosophile a été amenée dans le domaine de la modélisation des maladies humaines, y compris les troubles cardiaques. Le travail présenté décrit le système expérimental de surveillance et de manipulation de la fonction cardiaque dans le contexte d’un organisme vivant entier utilisant la lumière rouge (617 nm) et sans procédures invasives. Le contrôle du cœur a été réalisé à l’aide d’outils optogénétiques. L’optogénétique combine l’expression d’opsines transgéniques sensibles à la lumière et leur activation optique pour réguler le tissu biologique d’intérêt. Dans ce travail, un système intégré personnalisé d’imagerie par tomographie par cohérence optique (OCT) et de stimulation optogénétique a été utilisé pour visualiser et moduler le fonctionnement du cœur de D. melanogaster au stade larvaire du 3e stade et au début du développement nymphal. Le système génétique double UAS/GAL4 a été utilisé pour exprimer l’halorhodopsine (eNpHR2.0) et la channelrhodopsine décalée vers le rouge (ReaChR), en particulier dans le cœur de mouche. Des détails sur la préparation de D. melanogaster à l’imagerie OCT vivante et à la stimulation optogénétique sont fournis. Un logiciel d’intégration développé en laboratoire a traité les données d’imagerie pour créer des présentations visuelles et des caractéristiques quantitatives de la fonction cardiaque de la drosophile . Les résultats démontrent la faisabilité d’initier un arrêt cardiaque et une bradycardie causés par l’activation d’eNpHR2.0 et d’effectuer une stimulation cardiaque lors de l’activation de ReaChR.
Fin 2010, la revue Nature Methods a sélectionné l’optogénétique comme méthode de l’année1. L’utilisation d’outils génétiques (opsines transgéniques) régulées par la lumière pour contrôler les tissus biologiques d’intérêt avec une précision et une rapidité sans précédent a ouvert la voie à de nouvelles applications. À ce jour, la majorité des réalisations appartiennent aux neurosciences. La technologie a été introduite comme une nouvelle méthode de contrôle précis des neurones individuels2 et a progressé vers des découvertes dans le domaine des fonctions cognitives des organismes vivants3. Dès le début, les neuroscientifiques ont démontré la capacité de moduler le comportement de l’organisme entier. L’expression et l’activation lumineuse de l’opsine ChR2 chez les neurones dopaminergiques de souris ont provoqué leur activation et ont été suffisantes pour conduire le conditionnement comportemental4. L’inhibition optogénétique d’un sous-ensemble de neurones contenant de l’halorhodopsine NpHR2.0 délivrée au foyer épileptique du cerveau des rongeurs a entraîné une atténuation des crises électroencéphalographiques5.
Les applications optogénétiques en cardiologie se développent à un rythme soutenu6. ChR2 a été exprimé avec succès dans la culture cellulaire de cardiomyocytes et chez la souris; La stimulation cardiaque a été réalisée par des éclairs de lumière bleue (réalisée à l’aide d’une fibre implantée chez des animaux vivants)7. Chez le poisson zèbre, ChR2 a été exprimé et utilisé pour identifier la région cardiaque qui fait le rythme; L’activation de la NpHR a provoqué un arrêt cardiaque8. La stimulation cardiaque optogénétique a le potentiel unique de développer de nouvelles thérapies de stimulation et de resynchronisation9. Des tentatives d’établissement d’un système de terminaison d’arythmie autogène ont également été signalées récemment10.
Des recherches approfondies et le développement de nouveaux traitements thérapeutiques nécessitent l’application de divers systèmes modèles, de la culture cellulaire aux mammifères. Le cœur d’un vertébré est un organe très complexe. Les cardiomyocytes (CM) représentent un tiers de toutes les cellules cardiaques; Les autres cellules comprennent les neurones, les cellules musculaires lisses vasculaires et les cellules non excitables (c.-à-d. les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules immunitaires). La recherche sur la culture cellulaire CM limite la traduction des résultats obtenus aux applications médicales humaines. Les manipulations génétiques des organismes modèles de mammifères sont limitées et prennent beaucoup de temps. Les modèles d’invertébrés plus petits présentent de nombreux avantages; Leur système cardiovasculaire porte tous les éléments histologiques essentiels. Drosophila melanogaster (mouche des fruits) est un système de modèle génétique simple et puissant pour étudier le rôle des gènes associés aux maladies humaines, y compris les maladies cardiaques11,12,13. En tant qu’animaux à courte durée de vie, les mouches des fruits représentent une excellente occasion de modéliser les changements de la fonction cardiaque liés à l’âge ou à la maladie qui peuvent être retracés tout au long de la vie14,15,16,17. Le tube cardiaque de la mouche des fruits est situé sur la face dorsale de son corps à moins de 200 μm de la surface de la cuticule, permettant à la lumière visible à proche infrarouge d’atteindre le tube cardiaque. Cette caractéristique anatomique permet une stimulation optique non invasive du cœur de la drosophile à l’aide d’outils optogénétiques existants.
Pour surveiller le cœur de la drosophile, un système d’imagerie personnalisé de tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) avec un module d’excitation LED à lumière rouge intégré a été développé18. Les changements morphologiques et rythmiques dans un cœur de mouche des fruits relativement simple peuvent être facilement analysés avec cette technologie d’imagerie biomédicale non invasive 12,19,20,21. Grâce à des performances de sectionnement optique améliorées et à une résolution spatiale à l’échelle du micron, l’OCT a été utilisée avec succès pour étudier la structure et surveiller la fonction du cœur de la drosophile à différents stades de développement, y compris la larve du 3ème stade et la pupeprécoce 18. Ce système permet également de surveiller et de stimuler simultanément l’état cardiaque de la drosophile chez l’animal intact. Une vue schématique du système de l’OPO est illustrée à la figure 1. Le système SD-OCT utilise une diode superluminescente (SLD) comme source lumineuse (longueur d’onde centrale : 850 nm ± 10 nm, FWHM : 165 nm, voir Tableau des matériaux). En utilisant une lentille d’objectif 10x, le système d’imagerie OCT peut atteindre une résolution axiale de ~4,4 μm dans l’air et ~3,3 μm dans les tissus et une résolution latérale de ~2,8 μm, suffisante pour résoudre les détails fins des structures cardiaques de la mouche18,22. Les signaux d’interférence de la lumière réfléchie du bras de référence et du bras d’échantillonnage sont détectés à l’aide d’un spectromètre équipé d’une caméra à balayage linéaire de 2048 pixels (débit de ligne maximal : 80 kHz, voir le tableau des matériaux). La sensibilité du système mesurée est de ~95,1 dB. Chaque balayage OCT en mode B génère une image en coupe transversale dans le plan de l’image xz. Des images répétées en mode B sont acquises au même endroit pour créer des images en mode M capturant le cœur battant pendant plus de ~30 s 18,22,23. La fréquence d’images pour l’imagerie en mode M est de ~125 images / s, suffisante pour capturer la dynamique de battement du cœur de la mouche des fruits.
Pour la régulation optogénétique de la fonction cardiaque de la drosophile , un module d’éclairage avec une source lumineuse LED de 617 nm est intégré au bras échantillon du système SD-OCT. La lumière de stimulation est focalisée sur une tache de ~2,2 mm de diamètre sur la surface de l’échantillon, à la même position que la tache focale d’imagerie. Un logiciel personnalisé est utilisé pour contrôler le mode d’éclairage (intensité lumineuse, largeur d’impulsion et rapport cyclique), ajuster la fréquence de stimulation des impulsions lumineuses et synchroniser l’éclairage du module LED et l’acquisition d’images OCT en mode M22.
Des publications récentes ont décrit le système transgénique de la drosophile constitué d’opsines ChR2, ReaChR et eNpHR2.0 régulées spatio-temporellement en utilisant le système génétique UAS/GAL4. Les résultats obtenus ont démontré la capacité d’initier un arrêt cardiaque et une bradycardie causés par l’activation de la lumière rouge de l’eNpHR2.0 et une stimulation cardiaque à fréquence plus élevée causée par l’activation de la lumière bleue de ChR2. Des expériences de stimulation similaires ont été réalisées avec une autre channelrhodopsine, ReaChR, inductible par l’éclairage à la lumière rouge22,23,24. L’expression de l’opsine dans toutes les expériences décrites a été déterminée par 24B-GAL4, où l’expression de l’opsine a été observée dans un large éventail de tissus, y compris les cardiomyocytes et les cellules musculaires environnantes. Dans la présente étude, le 24B-GAL4 a été remplacé par un pilote Hand-GAL4 pour obtenir une expression d’opsines eNpHR2.0 et ReaChR spécifique au cœur.
Dans l’ensemble, les résultats expérimentaux présentés démontrent un arrêt cardiaque réparateur et des affections cardiaques inductibles de bradycardie et de tachycardie. Un protocole détaillé avec des instructions étape par étape sur la création de modèles de drosophile transgénique et la réalisation simultanée d’expériences d’imagerie OCT et de stimulation optogénétique sur des animaux vivants est fourni.
Par rapport à nos rapports précédents où l’expression des opsines était conduite non seulement dans le cœur, mais aussi dans les tissus musculaires environnants, les rapports de travail actuels utilisant un pilote spécifique au cœur, Hand-GAL4. Cette nouvelle configuration génétique Hand> opsin utilisée pour la régulation cardiaque optogénétique confirme les résultats précédemment rapportés et établit un meilleur modèle de recherche cardiovasculaire sur la drosophile .
La préparation des milieux est essentielle au succès des expériences. Les protéines d’opsine nécessitent un ligand, le tout-trans rétinien (ATR), pour fonctionner28. Les mouches ne produisent pas assez d’ATR, de sorte que l’ATR doit être complété aux milieux de mouche. Dans cette étude, l’aliment instantané précédemment rapporté a été remplacé par un milieu semi-défini29. La nouvelle recette de supports contenant de l’ATR a été introduite pour assurer une distribution uniforme de l’ATR. L’ATR n’est pas soluble dans l’eau; lorsque du stock d’ATR 100 mM à base d’éthanol est ajouté aux milieux à base d’eau, il est dispersé par vortex dans les flacons contenant des milieux semi-définis chauds. De plus, la concentration d’ATR précédemment signalée a été réduite de 10 mM pour eNpHR2.0 et de 3 mM pour ReaChR22 à une concentration finale de 1 mM pour les deux. Cette concentration est suffisante pour assurer la bonne fonction eNpHR2.0 et ReaChR.
Un élément essentiel du succès expérimental est l’amélioration du traitement des données avec FlyNet 2.027. Le laboratoire a continué à développer ce logiciel pour améliorer à la fois l’efficacité de calcul et la précision de l’algorithme automatisé de segmentation du cœur de mouche. Les masques en coupe transversale produits par ce logiciel sont utilisés pour dériver des données physiologiques de la drosophile telles que le raccourcissement fractionné et la vitesse de la paroi cardiaque. Cette approche a permis une analyse efficace des données avec une supervision humaine minimale, ce qui rend plus rapide et plus fiable la caractérisation de la fonction cardiaque pour les grands ensembles de données d’imagerie cardiaque de mouches.
L’infarctus du myocarde reste la principale cause de décès, et l’ischémie myocardique contribue aux deux tiers de tous les cas d’insuffisance cardiaque, qui émerge rapidement parmi les principales causes de mortalité et de morbidité aux États-Unis30. Le développement de nouveaux dispositifs thérapeutiques et médicaux nécessite une connaissance approfondie des mécanismes des troubles cardiaques aux niveaux physiologique et biochimique. Ces objectifs peuvent être atteints avec l’aide d’organismes modèles. D. melanogaster s’est imposé comme l’un des modèles les plus fiables et les plus efficaces 31,32,33,34,35. Ces travaux ont généré les modèles simulés de troubles cardiaques de la drosophile induits par une approche optogénétique non invasive. Le développement de technologies de stimulation cardiaque optique non invasives fournit une base pour le développement d’une alternative aux dispositifs de stimulation cardiaque électrique traditionnels. L’utilisation de la TCO pour observer la fonction cardiaque en temps réel permet aux études de caractériser avec précision la physiologie cardiaque pertinente dans les modèles de drosophile pour des investigations avancées, y compris le dépistage de candidats médicaments. L’imagerie OCT a une profondeur de pénétration de ~1 mm, ce qui fonctionne bien pour les études cardiaques sur la drosophile, mais limite son utilisation pour caractériser la fonction cardiaque dans des modèles animaux plus grands. De plus, traduire directement la recherche sur la drosophile en modèles de mammifères représente un défi. De nouveaux outils optogénétiques doivent être développés pour améliorer la sensibilité des opsines et les traduire en divers systèmes modèles, y compris le poisson zèbre, la souris, le rat et les organoïdes cardiaques humains, pour la recherche cardiovasculaire.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Andrey Komarov, Yuxuan Wang et Jiantao Zhu pour leur aide dans l’analyse des données et remercient les membres du laboratoire Zhou pour leurs précieuses discussions. Les travaux dans le laboratoire du Dr Zhou ont été soutenus par un fonds de démarrage de l’Université Washington à St. Louis, les subventions R01-EB025209 et R01-HL156265 des National Institutes of Health (NIH) et le prix de recherche innovante de la Fondation Clayco.
All-trans retinal | Cayman Chemicals | 18449 | |
Bacto Peptone | Gibco | 02-10-2025 | |
BioLED Light Source Control Module, 4-channel | Migtex Systems | BLS-SA04-US | Part of the optogenetic stimulation module |
Broadband Light Source Module | Superlum | cBLMD-T-850-HP | Part of the SD-OCT imaging system |
Cobra-S 800 OCT Spectrometers | Wasatch Photonics | CS800-840/180-80-OC2K-U3 | Part of the SD-OCT imaging system |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professtional | 34155 | tissues |
Drosophila agar | Genesee Scientific | 66-103 | |
Drosophila culture bottles | Genesee Scientific | 32-131 | |
FlyNet 2.0 Software | Z-Lab | Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab | |
High-Power LED Collimator Sources | Migtex Systems | BLS-LCS-0617-03-22 | Part of the optogenetic stimulation module |
Inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-106 | |
Microscope slides | AmScope | BS-72P | |
Narrow plugs for Drosophila culture | Genesee Scientific | 59-200 | |
Narrow vials for Drosophila culture | Genesee Scientific | 32-116SB | |
Permanent double-sided tape | Scotch | ||
Plugs for Drosophila bottles | Genesee Scientific | 59-194 | |
Propionic Acid | Sigma | P1386-1L | |
SD-OCT control software | Z-Lab | Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab | |
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system | Z-Lab | Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM) | |
Sucrose | Carolina | 89-2871 | |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 41752 | eNpHR2.0 transgenic line |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 53748 | ReaChR transgenic line |
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 48396 | Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment |
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock #6658 | GFP reporter line |
Yeast extract | Lab Scientific bioKEMIX | 978-907-4243 |