Summary

Acoustopforese microfluidica para flowthrough separação de bactérias gram-negativas usando Contas de Afinidade De Aptamer

Published: October 17, 2022
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Summary

Este artigo descreve a fabricação e o funcionamento de chips acoustopforéticos microfluidos usando a técnica de austopforese microfluidica e microesferas modificadas por aptamer que podem ser usadas para o isolamento rápido e eficiente de bactérias Gram-negativas a partir de um meio.

Abstract

Este artigo descreve a fabricação e o funcionamento de chips acoustopforéticos microfluidos usando uma técnica de austopforese microfluídica e microesferas modificadas por aptamer que podem ser usadas para o isolamento rápido e eficiente de bactérias Gram-negativas de um meio. Este método aumenta a eficiência de separação usando uma mistura de microcanais longos e quadrados. Neste sistema, a amostra e o buffer são injetados na porta de entrada através de um controlador de fluxo. Para centralizar as contas e separar amostras, a energia CA é aplicada no transdutor piezoelétrico através de um gerador de função com um amplificador de energia para gerar força de radiação acústica no microcanal. Há um canal bifurcado tanto na entrada quanto na saída, permitindo separação simultânea, purificação e concentração. O dispositivo tem uma taxa de recuperação de >98% e pureza de 97,8% até uma concentração de 10x de dose. Este estudo demonstrou uma taxa de recuperação e pureza superior aos métodos existentes para separar bactérias, sugerindo que o dispositivo pode separar as bactérias de forma eficiente.

Introduction

Plataformas microfluídicas estão sendo desenvolvidas para isolar bactérias de amostras médicas e ambientais, além de métodos baseados na transferência dielétrica, magnetoforese, extração de contas, filtragem, microfluidos centrífugas e efeitos inerciais, e ondas acústicas superficiais 1,2. A detecção de bactérias patogênicas continua usando reação em cadeia de polimerase (PCR), mas geralmente é trabalhosa, complexa e demorada 3,4. Os sistemas de austopforese microfluidica são uma alternativa para lidar com isso através de rendimento razoável e isolamento celular sem contato 5,6,7. Acoustophoresis é uma tecnologia que separa ou concentra contas usando o fenômeno do movimento material através de uma onda sonora. Quando as ondas sonoras entram no microcanal, elas são classificadas de acordo com o tamanho, densidade, etc., das contas, e as células podem ser separadas de acordo com as propriedades bioquímicas e elétricas do meio de suspensão 7,8. Assim, muitos estudos aoustopforéticos foram ativamente perseguidos 9,10,11, e recentemente, simulações numéricas 3D de movimento acoustopforético induzido pelo streaming acústico orientado por limites em microfluidos de onda acústica de superfície em pé foram introduzidas12.

Estudos em diversas áreas estão examinando como substituir anticorpos 2,3. Aptamer é um material-alvo com alta seletividade e especificidade, e muitos estudos estão sendo realizados 2,9,10,13. Os aptamers têm vantagens de pequeno porte, excelente estabilidade biológica, baixo custo e alta reprodutibilidade em relação aos anticorpos e estão sendo estudados em aplicações diagnósticas e terapêuticas 2,3,14.

Aqui, este artigo descreve um protocolo de tecnologia de acoustopforese microfluídica que pode ser usado para a rápida e eficiente separação de bactérias Gram-negativas (GN) de um meio usando microesferas modificadas por aptamer. Este sistema gera uma onda de pé acústica bidimensional (2D) através da atuação piezoelétrica única, estimulando simultaneamente duas ressonâncias ortogonais dentro de um microcanal retangular longo para alinhar e focar microesferas ligadas a aptamer nos pontos de nó e anti-nó para eficiência de separação 2,11,15,16 . Há um canal bifurcado tanto na entrada quanto na saída, permitindo separação simultânea, purificação e concentração.

Este protocolo pode ser útil no campo do diagnóstico precoce de doenças infecciosas bacterianas, bem como uma resposta rápida, seletiva e sensível a infecções bacterianas patogênicas através do monitoramento da água em tempo real.

Protocol

1. Design de chip de acoustopforese microfluídica NOTA: A Figura 1 mostra um esquema da separação e coleta de microesferas-alvo de microcanais por acoustopforese. O chip de austopforese microfluídica é projetado com um programa CAD. Projete um chip de acoustopforese microfluida que usa uma mistura de contas modificadas por aptámero e contas de poliestireno revestidos de streptavidin (PS) correspondentes ao tamanho das bactérias pa…

Representative Results

A Figura 5 mostra a imagem do fluxo de contas em função da tensão PZT (OFF, 0,1 V, 0,5 V, 5 V). No caso do chip acoustopforético introduzido neste estudo, foi confirmado que, à medida que a tensão do PZT aumentava, a concentração central das contas de 10 μm aumentava. A maioria das contas de 10 μm de tamanho estavam concentradas no centro a 5 V da tensão PZT. Através deste resultado, uma frequência ressonante de 3,66 MHz foi gerada em um gerador de função de um único canal, e…

Discussion

Desenvolvemos um dispositivo microfluido de levitação sônica para capturar e transferir bactérias GN de amostras de cultura em alta velocidade com base em um método de execução contínuo de acordo com seu tamanho e tipo, e microesferas modificadas por aptamer. O microcanal longo e quadrado permite um design mais simples e maior custo-benefício para a 2D acoustophoresis do que o relatado anteriormente 20,21,22,23,24,25,26.</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo coreano (Ministério da Ciência e TIC). (Não. NRF-2021R1A2C1011380)

Materials

1 µm polystyrene microbeads Bang Laboratories PS04001 Cell size beads
10 µm Streptavidin-coated microbeads Bang Laboratories CP01007 Aptamer affinity beads
4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold 4science 29-03573-01 Components of chip
Aptamer Integrated DNA Technologies GN3-6' RNA for bacteria conjugation
Borosilicate glass Schott BOROFLOAT 33 Components of chip
Centrifuge Daihan CF-10 Wasing particles
Cyanoacrylate glue 3M AD100 Attach PZT to microchip
Escherichia coli DH5α KCTC KCTC2571 Target bacteria
Functional generator GW Instek AFG-2225 Generate frequency
High-speed camera Photron FASTCAM Mini Observation of separation
Hot plate As one HI-1000 Heating plate for curing of liquid PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe Koreavaccine 22G-10ML Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water.
Liquid polydimethylsiloxane, PDMS Dow Corning Inc. Sylgard 184 Components of chip
LB Broth Miller BD Difco 244620 Cell culture (Luria-Bertani medium)
Microscope Olympus Corp. IX-81 Observation of separation
PBS buffer Capricorn scientific PBS-1A Wasing bacteria
PEEK Tubes Saint-Gobain Ppl Corp. AAD04103 Inject or collect particles
Piezoelectric transducer Fuji Ceramics C-213 Generate specific wave in channel
Power amplifier Amplifier Research 75A250A Amplify frequency
Pressure controller/μflucon AMED AMED-μflucon Control of air pressure/flow controller
Tris-HCl buffer invitrogen 15567027 Wasing particles
Tube rotator SeouLin Bioscience SLRM-3 Modifiying aptamer and bead

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Cite This Article
Choi, H. J., Kim, B. W., Lee, S., Jeong, O. C. Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads. J. Vis. Exp. (188), e63300, doi:10.3791/63300 (2022).

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