Summary

Aptamer 친화성 비드를 사용한 그람 음성 박테리아의 유류 분리를 위한 미세유체 Acoustophoresis

Published: October 17, 2022
doi:

Summary

이 논문은 배지로부터 그람 음성 박테리아의 빠르고 효율적인 분리를 위해 사용될 수 있는 미세유체 acoustophoresis 기술 및 앱타머-개질된 마이크로비드를 사용하는 마이크로유체 acoustophoretic 칩의 제조 및 작동을 설명한다.

Abstract

이 글에서는 배지로부터 그람 음성 박테리아를 빠르고 효율적으로 분리하는 데 사용할 수 있는 미세유체 acoustophoresis 기술 및 앱타머-개질된 마이크로비드를 이용한 미세유체 acoustophoretic 칩의 제조 및 작동에 대해 설명한다. 이 방법은 긴 사각형 마이크로 채널의 혼합을 사용하여 분리 효율을 향상시킵니다. 이 시스템에서, 샘플과 버퍼는 유동 제어기를 통해 입구 포트로 주입된다. 비드 센터링 및 샘플 분리를 위해 AC 전력은 전력 증폭기가 있는 함수 발생기를 통해 압전 트랜스듀서에 인가되어 마이크로채널에서 음향 방사력을 생성합니다. 입구와 출구 모두에 분기 채널이 있어 분리, 정화 및 농축을 동시에 수행할 수 있습니다. 이 장치는 10x 용량 농도까지 >98 %의 회복률과 97.8 %의 순도를 가지고 있습니다. 이 연구는 박테리아를 분리하는 기존의 방법보다 높은 회수율과 순도를 입증했으며, 이는 장치가 박테리아를 효율적으로 분리 할 수 있음을 시사합니다.

Introduction

유전체 전달, 자기 영동, 비드 추출, 필터링, 원심 미세 유체 공학 및 관성 효과, 표면 음향파 1,2에 기반한 방법 외에도 의료 및 환경 샘플에서 박테리아를 분리하기 위해 미세 유체 플랫폼이 개발되고 있습니다. 병원성 박테리아의 검출은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 계속되지만, 일반적으로 힘들고 복잡하며 시간이 많이 걸립니다 3,4. 미세유체 acoustophoresis 시스템은 합리적인 처리량 및 비접촉 세포 분리 5,6,7을 통해 이를 해결하기 위한 대안이다. Acoustophoresis는 음파를 통한 물질 이동 현상을 이용하여 비드를 분리하거나 농축하는 기술입니다. 음파가 마이크로채널에 들어갈 때, 이들은 비드의 크기, 밀도 등에 따라 분류되고, 세포는 현탁액 매질(7,8)의 생화학적 및 전기적 특성에 따라 분리될 수 있다. 이에 따라, 많은 acoustophoretic 연구가 활발히 추진되고 있으며, 최근에는 서표면 음향파 미세유체학에서 경계 구동 음향 스트리밍에 의해 유도되는 음향 영동 운동의 3D 수치 시뮬레이션(12)이 도입되었다.

다양한 분야의 연구는 항체 2,3을 대체하는 방법을 조사하고 있습니다. 압타머는 높은 선택성과 특이성을 갖는 표적 물질이며, 많은 연구가 2,9,10,13 진행되고 있다. Aptamers는 항체에 비해 작은 크기, 우수한 생물학적 안정성, 저렴한 비용 및 높은 재현성의 장점을 가지고 있으며 진단 및 치료 응용분야에서 연구되고 있습니다 2,3,14.

여기서, 본 글에서는 앱타머 변형된 마이크로비드를 사용하는 배지로부터 그람 음성(GN) 박테리아를 신속하고 효율적으로 분리하는데 사용될 수 있는 미세유체 acoustophoresis 기술 프로토콜을 설명한다. 이 시스템은 긴 직사각형 마이크로채널 내에서 두 개의 직교 공진을 동시에 자극하여 단일 압전 작동을 통해 2차원(2D) 음향 스탠딩파를 생성하여 노드와 안티노드 포인트에서 압타머 부착 마이크로비드를 정렬하고 집중시켜 분리 효율 2,11,15,16 . 입구와 출구 모두에 분기 채널이 있어 분리, 정화 및 농축을 동시에 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜은 박테리아 전염병의 조기 진단 분야뿐만 아니라 실시간 물 모니터링을 통해 병원성 박테리아 감염에 대한 신속하고 선택적이며 민감한 반응에 도움이 될 수 있습니다.

Protocol

1. 미세 유체 acoustophoresis 칩 디자인 참고: 도 1 은 acoustophoresis에 의한 마이크로채널로부터 표적 마이크로비드의 분리 및 수집의 개략도를 도시한다. 미세유체 acoustophoresis 칩은 CAD 프로그램으로 설계되었습니다. 장치의 분리 성능을 연구하기 위해 박테리아의 크기에 해당하는 앱타머 변형 비드와 스트렙타비딘 코팅 폴리스티렌(PS) 비?…

Representative Results

도 5는 PZT 전압(OFF, 0.1 V, 0.5 V, 5 V)의 함수로서 비드 유동의 이미지를 도시한다. 본 연구에 도입된 acoustophoretic 칩의 경우, PZT의 전압이 증가함에 따라, 10 μm 크기의 비드의 중심 농도가 증가하는 것을 확인하였다. 10 μm 크기의 비드의 대부분은 PZT 전압의 5 V에서 중앙에 농축되었다. 이 결과를 통해 단일 채널 함수 발생기에서 3.66MHz의 공진 주파수가 생성되었고, 전력 증폭기를 ?…

Discussion

배양 시료로부터 GN 박테리아를 포획하여 그 크기와 종류에 따른 연속 실행 방법 및 앱타머 변형 마이크로비드를 기반으로 고속으로 포획하고 이송하기 위한 음파 부양 미세유체 장치를 개발하였다. 긴 정사각형 마이크로채널은 이전에 보고된 20,21,22,23,24,25,26보다 더 간단한 설계와<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 사업은 한국연구재단(NRF) 한국 정부(과학기술정보통신부)가 후원하는 보조금의 지원을 받았다. (아니요. NRF-2021R1A2C1011380)

Materials

1 µm polystyrene microbeads Bang Laboratories PS04001 Cell size beads
10 µm Streptavidin-coated microbeads Bang Laboratories CP01007 Aptamer affinity beads
4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold 4science 29-03573-01 Components of chip
Aptamer Integrated DNA Technologies GN3-6' RNA for bacteria conjugation
Borosilicate glass Schott BOROFLOAT 33 Components of chip
Centrifuge Daihan CF-10 Wasing particles
Cyanoacrylate glue 3M AD100 Attach PZT to microchip
Escherichia coli DH5α KCTC KCTC2571 Target bacteria
Functional generator GW Instek AFG-2225 Generate frequency
High-speed camera Photron FASTCAM Mini Observation of separation
Hot plate As one HI-1000 Heating plate for curing of liquid PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe Koreavaccine 22G-10ML Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water.
Liquid polydimethylsiloxane, PDMS Dow Corning Inc. Sylgard 184 Components of chip
LB Broth Miller BD Difco 244620 Cell culture (Luria-Bertani medium)
Microscope Olympus Corp. IX-81 Observation of separation
PBS buffer Capricorn scientific PBS-1A Wasing bacteria
PEEK Tubes Saint-Gobain Ppl Corp. AAD04103 Inject or collect particles
Piezoelectric transducer Fuji Ceramics C-213 Generate specific wave in channel
Power amplifier Amplifier Research 75A250A Amplify frequency
Pressure controller/μflucon AMED AMED-μflucon Control of air pressure/flow controller
Tris-HCl buffer invitrogen 15567027 Wasing particles
Tube rotator SeouLin Bioscience SLRM-3 Modifiying aptamer and bead

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Choi, H. J., Kim, B. W., Lee, S., Jeong, O. C. Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads. J. Vis. Exp. (188), e63300, doi:10.3791/63300 (2022).

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