Aptamer Afinite Boncukları Kullanılarak Gram-Negatif Bakterilerin Akış Yoluyla Ayrılması için Mikroakışkan Akustoforez
Summary
Bu makalede, mikroakışkan akustoforez tekniği ve Gram-negatif bakterilerin bir ortamdan hızlı ve verimli bir şekilde izole edilmesi için kullanılabilecek aptamer modifiye mikroboncuklar kullanılarak mikroakışkan akustohoretik çiplerin üretimi ve işletilmesi açıklanmaktadır.
Abstract
Bu makalede, mikroakışkan akustoforez tekniği ve Gram-negatif bakterilerin bir ortamdan hızlı ve verimli bir şekilde izole edilmesi için kullanılabilecek aptamer modifiye mikroboncuklar kullanılarak mikroakışkan akustohoretik çiplerin üretimi ve işletilmesi açıklanmaktadır. Bu yöntem, uzun, kare mikro kanalların bir karışımını kullanarak ayırma verimliliğini artırır. Bu sistemde, numune ve tampon bir akış kontrolörü aracılığıyla giriş portuna enjekte edilir. Boncuk merkezleme ve numune ayırma için, AC gücü, mikrokanalda akustik radyasyon kuvveti üretmek için bir güç amplifikatörü ile bir fonksiyon üreteci aracılığıyla piezoelektrik dönüştürücüye uygulanır. Hem giriş hem de çıkışta çatallı bir kanal vardır, bu da aynı anda ayırma, saflaştırma ve konsantrasyon sağlar. Cihaz,% >98’lik bir iyileşme oranına ve% 97.8’lik bir saflığa, 10x doz konsantrasyonuna kadar% 97.8’lik bir saflığa sahiptir. Bu çalışma, bakterileri ayırmak için mevcut yöntemlerden daha yüksek bir iyileşme oranı ve saflık göstermiştir, bu da cihazın bakterileri verimli bir şekilde ayırabileceğini düşündürmektedir.
Introduction
Dielektrik transfer, manyetoforez, boncuk ekstraksiyonu, filtreleme, santrifüjlü mikroakışkanlar ve atalet etkileri ve yüzey akustik dalgaları 1,2’ye dayalı yöntemlere ek olarak, bakterileri tıbbi ve çevresel örneklerden izole etmek için mikroakışkan platformlar geliştirilmektedir. Patojenik bakterilerin tespiti polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak devam eder, ancak genellikle zahmetli, karmaşık ve zaman alıcıdır 3,4. Mikroakışkan akustoforez sistemleri, makul verim ve temassız hücre izolasyonu 5,6,7 yoluyla bunu ele almak için bir alternatiftir. Akustoforez, bir ses dalgası boyunca maddi hareket fenomenini kullanarak boncukları ayıran veya yoğunlaştıran bir teknolojidir. Ses dalgaları mikrokanala girdiğinde, boncukların büyüklüğüne, yoğunluğuna vb. göre sıralanır ve hücreler, süspansiyon ortamı 7,8’in biyokimyasal ve elektriksel özelliklerine göre ayrılabilir. Buna göre, birçok akustophoretic çalışma aktif olarak 9,10,11 takip edilmiş ve son zamanlarda, ayakta duran yüzey akustik dalga mikroakışkanlarında sınır güdümlü akustik akış tarafından indüklenen akustophoretik hareketin 3D sayısal simülasyonları tanıtılmıştır 12.
Çeşitli alanlardaki çalışmalar antikorların nasıl değiştirileceğini incelemektedir 2,3. Aptamer, yüksek seçiciliğe ve özgüllüğe sahip bir hedef malzemedir vebirçok çalışma 2,9,10,13 yürütülmektedir. Aptamerler, antikorlara kıyasla küçük boyutlu, mükemmel biyolojik stabilite, düşük maliyetli ve yüksek tekrarlanabilirlik avantajlarına sahiptir ve tanı ve tedavi uygulamalarında incelenmektedir 2,3,14.
Burada, bu makalede, aptamer modifiye mikroboncuklar kullanılarak Gram-negatif (GN) bakterilerin bir ortamdan hızlı ve verimli bir şekilde ayrılması için kullanılabilecek bir mikroakışkan akustoforez teknolojisi protokolü açıklanmaktadır. Bu sistem, uzun bir dikdörtgen mikrokanal içindeki iki ortogonal rezonansı aynı anda uyararak, ayırma verimliliği için düğüm ve anti-düğüm noktalarında aptamer bağlı mikroboncukları hizalamak ve odaklamak için tek piezoelektrik çalıştırma yoluyla iki boyutlu (2B) akustik durağan bir dalga üretir 2,11,15,16 . Hem giriş hem de çıkışta çatallı bir kanal vardır, bu da aynı anda ayırma, saflaştırma ve konsantrasyon sağlar.
Bu protokol, bakteriyel bulaşıcı hastalıkların erken teşhisi ve gerçek zamanlı su izleme yoluyla patojenik bakteriyel enfeksiyonlara hızlı, seçici ve hassas bir yanıt alanında yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
GN bakterilerini kültür örneklerinden boyutlarına ve türlerine göre sürekli çalışan bir yönteme ve aptamer modifiye edilmiş mikro boncuklara dayanarak yüksek hızda yakalamak ve aktarmak için sonik bir levitasyon mikroakışkan cihazı geliştirdik. Uzun, kare mikrokanal, 2D akustoforez için daha önce bildirilen 20,21,22,23,24,25,26’dan daha basit bir tasarım ve daha fazla maliyet verimliliği sağlar.</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Kore hükümeti (Bilim ve BİT Bakanlığı) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) hibesi tarafından desteklenmiştir. (Hayır. NMK-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
- Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
- Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
- Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
- Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
- Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
- Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
- Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Klussmann, S. . The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , (2006).
- Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
- Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
- Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
- Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
- Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
- Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
- Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
- Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
- Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
- Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).
