Summary

アプタマーアフィニティービーズを使用したグラム陰性菌のフロースルー分離のためのマイクロ流体音響泳動

Published: October 17, 2022
doi:

Summary

本稿では、マイクロ流体音響泳動技術と、培地からのグラム陰性菌の迅速かつ効率的な単離に使用できるアプタマー修飾マイクロビーズを用いたマイクロ流体音響ホレストリーチップの製造と操作について説明します。

Abstract

この記事では、マイクロ流体音響泳動技術と、培地からのグラム陰性菌の迅速かつ効率的な単離に使用できるアプタマー修飾マイクロビーズを使用したマイクロ流体音響ホレスティックチップの製造と操作について説明します。この方法は、長い正方形のマイクロチャネルのミックスを使用して分離効率を高めます。このシステムでは、サンプルとバッファーはフローコントローラを介して入口ポートに注入されます。ビーズセンタリングとサンプル分離のために、パワーアンプを備えたファンクションジェネレータを介して圧電トランスデューサにAC電力を印加し、マイクロ流路に音響放射力を発生させます。入口と出口の両方に二股のチャネルがあり、同時に分離、精製、濃縮が可能です。この装置は、10倍の用量濃度まで>98%の回収率および97.8%の純度を有する。この研究は、細菌を分離するための既存の方法よりも高い回収率および純度を実証しており、この装置が細菌を効率的に分離できることを示唆している。

Introduction

マイクロ流体プラットフォームは、誘電体移動、磁気泳動、ビーズ抽出、フィルタリング、遠心マイクロ流体学および慣性効果、および弾性表面波1,2に基づく方法に加えて、医療および環境サンプルから細菌を単離するために開発されている。病原菌の検出はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて継続されますが、通常は手間がかかり、複雑で、時間がかかります3,4。マイクロ流体音響泳動システムは、合理的なスループットと非接触細胞分離567を通じてこれに対処する代替手段です。アコーストフォレーシスは、音波を介した物質の動きの現象を利用してビーズを分離または濃縮する技術です。マイクロ流路に音波が入ると、ビーズの大きさ、密度等に応じて選別され、浮遊培地7,8の生化学的・電気的性質に応じて細胞を分離することができる。そこで、多くの音響フォレーシス研究が盛んに進められ91011、最近では、立地弾性表面波マイクロ流体における境界駆動音響ストリーミングによって誘導される音響ホア運動の3D数値シミュレーションが導入されている12

様々な分野の研究が抗体を置き換える方法を検討しています 2,3.アプタマーは高い選択性と特異性を有する標的物質であり、291013と多くの研究が行われている。アプタマーは、抗体と比較して小型、優れた生物学的安定性、低コスト、および高い再現性の利点を有し、診断および治療用途で研究されている2314

ここでは、アプタマー修飾マイクロビーズを使用して、培地からグラム陰性(GN)細菌を迅速かつ効率的に分離するために使用できるマイクロ流体音響泳動技術プロトコルについて説明します。このシステムは、長い長方形のマイクロ流路内で2つの直交共鳴を同時に刺激し、アプタマー結合マイクロビーズをノード点と対ノード点に整列させ、焦点を合わせることによって、単一の圧電作動を介して2次元(2D)音響定在波を生成し、分離効率2,11,15,16.入口と出口の両方に二股のチャネルがあり、同時に分離、精製、濃縮が可能です。

このプロトコルは、細菌感染症の早期診断、ならびにリアルタイムの水モニタリングによる病原性細菌感染に対する迅速、選択的、かつ敏感な応答の分野で役立ちます。

Protocol

1. マイクロ流体音響泳動チップ設計 メモ:図1は、音響泳動によるマイクロチャネルからのターゲットマイクロビーズの分離と収集の概略 図 を示しています。マイクロ流体音響泳動チップは、CADプログラムを使用して設計されています。 細菌の大きさに対応するアプタマー修飾ビーズとストレプトアビジン被覆ポリスチレン(PS)?…

Representative Results

図5 は、PZT電圧(オフ、0.1V、0.5V、5V)の関数としてのビードフローの画像を示しています。本研究で紹介した音響フォレティックチップの場合、PZTの電圧が上昇するにつれて、10μmサイズのビーズの中心濃度が上昇することが確認された。10μmサイズのビーズのほとんどは、PZT電圧の5Vで中央に集中していました。この結果により、シングルチャンネルファンクションジェ?…

Discussion

培養試料中のGN細菌を、その大きさや種類に応じた連続走行法に基づき、高速で捕捉・移送する音波浮上マイクロ流体装置と、アプタマー修飾マイクロビーズを開発しました。長い正方形のマイクロチャネルにより、以前に報告された20、21、22、232425<sup class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、韓国政府(科学情報化部)の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成金によって支援されました。(いいえ。NRF-2021R1A2C1011380)

Materials

1 µm polystyrene microbeads Bang Laboratories PS04001 Cell size beads
10 µm Streptavidin-coated microbeads Bang Laboratories CP01007 Aptamer affinity beads
4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold 4science 29-03573-01 Components of chip
Aptamer Integrated DNA Technologies GN3-6' RNA for bacteria conjugation
Borosilicate glass Schott BOROFLOAT 33 Components of chip
Centrifuge Daihan CF-10 Wasing particles
Cyanoacrylate glue 3M AD100 Attach PZT to microchip
Escherichia coli DH5α KCTC KCTC2571 Target bacteria
Functional generator GW Instek AFG-2225 Generate frequency
High-speed camera Photron FASTCAM Mini Observation of separation
Hot plate As one HI-1000 Heating plate for curing of liquid PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe Koreavaccine 22G-10ML Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water.
Liquid polydimethylsiloxane, PDMS Dow Corning Inc. Sylgard 184 Components of chip
LB Broth Miller BD Difco 244620 Cell culture (Luria-Bertani medium)
Microscope Olympus Corp. IX-81 Observation of separation
PBS buffer Capricorn scientific PBS-1A Wasing bacteria
PEEK Tubes Saint-Gobain Ppl Corp. AAD04103 Inject or collect particles
Piezoelectric transducer Fuji Ceramics C-213 Generate specific wave in channel
Power amplifier Amplifier Research 75A250A Amplify frequency
Pressure controller/μflucon AMED AMED-μflucon Control of air pressure/flow controller
Tris-HCl buffer invitrogen 15567027 Wasing particles
Tube rotator SeouLin Bioscience SLRM-3 Modifiying aptamer and bead

References

  1. Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
  2. Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
  3. Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
  4. Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
  5. Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
  6. Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
  7. Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
  8. Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
  9. Klussmann, S. . The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , (2006).
  10. Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  11. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  12. Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
  13. Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
  14. Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
  15. Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  16. Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
  17. Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
  18. Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
  19. Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
  20. Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
  21. Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
  22. Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
  23. Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  24. Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
  25. Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
  26. Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).

Play Video

Cite This Article
Choi, H. J., Kim, B. W., Lee, S., Jeong, O. C. Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads. J. Vis. Exp. (188), e63300, doi:10.3791/63300 (2022).

View Video