Summary

エクスビボ マウスの門脈を通る肝臓灌流

Published: March 09, 2022
doi:

Summary

このプロトコルは、門脈灌流による代謝研究のために無傷のマウス肝臓を切除する簡単な方法を記載している。

Abstract

糖尿病、前糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、および非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)などの代謝性疾患は、ますます一般的になりつつある。エクスビボ肝臓灌流は、厳密に制御できる栄養条件下で、核磁気共鳴(NMR)を使用して肝臓代謝の包括的な分析を可能にします。インシリコシミュレーションは、ホルモン作用および薬物介入の効果を評価するための主に理論的手段であり続けているように、灌流肝臓は、肝代謝を理解するための最も貴重な試験床の1つであり続けている。これらの研究は肝生理学への基本的な洞察を導くので、結果は正確で再現性がなければなりません。生体外肝灌流の再現性における最大の要因は、手術の質である。そこで、我々は、in situNMR実験の文脈でエクスビボマウス肝臓灌流を行うための組織的かつ合理化された方法を導入した。また、ユニークなアプリケーションについて説明し、これらの研究で遭遇する一般的な問題についても説明します。全体的な目的は、in situNMR実験の文脈で肝切除および灌流において再現性のある結果を得るためのゴールデンスタンダードと見なす、数年間にわたって洗練されてきた技術への単純なガイドを提供することです。磁石の磁場の中心までの距離と、NMR実験中の介入に対する組織のアクセス不能は、私たちの方法を新規なものにします。

Introduction

生体外灌流は肝代謝の研究において極めて重要であり、門脈を介した灌流はこれらの研究の標準である。単独で肝代謝を研究するためには、肝臓を体内から切除して、他の器官における代謝から生じる合併症(すなわち、全身代謝)を回避し、ホルモンの利用可能性(インスリン、グルカゴンなど)を制御する必要があります。このアプローチは、糖尿病、NAFLD、NASHなどの疾患が肝代謝に及ぼす影響や薬物作用のメカニズムを理解するために不可欠です。この記事は、肝切除と灌流のガイドとして機能します。我々は、これらの代謝肝研究を十分な厳密さと再現性で実施するための合理化された手順を開発しました。手術が正しく行われない場合、得られる代謝データに顕著な変動性がある。我々は、文献12345に記載されているように核磁気共鳴(NMR)分光計におけるその場での代謝研究の文脈で門脈カテーテル法および肝臓切除を行うための組織化された方法を説明する。

現在、NMR内のガラスカラムを用いた ex vivo 肝灌流を記載した文献はない。また、マウス肝臓で手順を実行する方法の明確な例を提供するビデオやテキストの出版物、具体的には、門脈をカテーテル法し、肝臓を切除し、肝臓を移し、ガラス柱に吊るす方法を示すものもありません。遺伝子組み換えマウスは肝臓代謝の研究に遍在的に使用されているため、これは完全な説明に値する不可欠な手順です。肝臓灌流手術は新しいものではありませんが、この記事はゴールドスタンダードな方法であり、この手順に関心のあるすべての人を支援するために、このペーパーに記載されている技術的卓越性を示すビデオが添付されています。ここで提示された方法は、疾患モデルにおける代謝産物の機能および代謝回転を検出するために、リアルタイム代謝に最もよく適用されるであろう。

この方法は、NMRチューブ内の灌流液によって封入されたカニューレの底に肝臓を吊るすことを可能にする100cmのウォータージャケット付きガラスカラムを使用する。ガラスジャケット内の加熱された水は、灌流液温度を制御するために使用されます。薄層酸素化器は、pH制御のために95%/5%O2/CO2で加圧される。3つの別々のポンプを使用することにより、灌流液カラムの高さが設定され、肝臓に一定の圧力が供給される。流量は、一定の圧力の印加を超えて制御されません(図1)。肝臓が適切に機能していることを確認するために、酸素測定が流量とともに行われます。私たちの手では、この一連の前提条件は、肝臓代謝機能の評価のための再現性の高いNMR実験につながります。

Protocol

マウスを含む実験は、フロリダ大学施設動物ケアおよび使用委員会(プロトコル番号#201909320)に準拠して処理した。使用したマウス株はC57BL/6Jであった。全てのマウスは雄であった。この方法は、一般に、他の標準的なマウス系統を用いた研究にも適用可能である。この手術は、一緒に働く2人の個人によって最適に行われます。 1. 初期設定 クレブス・?…

Representative Results

肝機能は、主に酸素消費量と流量によって評価されます。4 ~ 8 mL/分の流量と 1 μmol/min.g の酸素消費量が典型的です。これらの尺度は、特定の実験条件および生物学的差異によって異なるであろう。 使用されるイソフルランの正確な量は、使用されている麻酔システムの種類、ならびにマウスの環境および年齢/体重に依存する。手術中、イソフルランおよび送達ガスは変?…

Discussion

この外科的処置は困難であり、再現性のある結果を達成するために広範な練習を必要とする。イソフルランおよびキャリアガスは、できるだけ多くの外科的処置を通して動物の生存率を維持するために、必要に応じて調整されるべきである。環境、時刻、年齢、体重、およびその他のいくつかの要因が麻酔に影響を与えます。体重、食事、マウスの系統、年齢は、脂肪の蓄積が門脈の視覚化?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立衛生研究所(R01-DK105346、P41-GM122698、5U2C-DK119889)からの資金提供によって支援された。この研究の一部は、国立科学財団協力協定No.の支援を受けている国立高磁場研究所の先端磁気共鳴イメージングおよび分光法(AMRIS)施設のMcKnight Brain Instituteで行われました。DMR-1644779とフロリダ州。

Materials

1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe N/A N/A Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column N/A N/A Custom Made
2-0 Silk Suture Braintree Scientific N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety Terumo SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles Exel International 26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles Exel International 26426
4×4 in. Surgical Platform N/A N/A Custom Made
70% Alcohol Wipe N/A N/A Non-specific Brand
Circulating Water Bath MS Lauda N/A Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator N/A N/A Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " Roboz RS-6702
Dumont #5/45 Forceps Fine Scientific Tools 11251-35
Dumont #7 – Fine Forceps Fine Scientific Tools 11274-20
Hemostats Fine Scientific Tools 13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL RX Generics 71288-0402-02
Isoflurane Patterson Veterinary 14043-0704-06
Lidocaine HCl 2% VEDCO Inc. 50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator Radnoti N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " Roboz RS-6013
Oxygen Meter System Hanstech Instruments Ltd. N/A
Saline 0.9% Solution N/A N/A Saline is made in lab
Scale N/A N/A Non-specific Brand
 Variable Speed Analog Console Pump Systems Cole Palmer N/A Models are custom per application
Weigh boats N/A N/A Non-specific Brand

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Cite This Article
Giacalone, A. G., Merritt, M. E., Ragavan, M. Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse. J. Vis. Exp. (181), e63154, doi:10.3791/63154 (2022).

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