Summary

Ex vivo Leberperfusion durch die Portalader in der Maus

Published: March 09, 2022
doi:

Summary

Das Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Resektion einer intakten Mausleber für Stoffwechselstudien durch Pfortaderperfusion.

Abstract

Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes, Prädiabetes, nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) und nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) werden immer häufiger. Ex-vivo-Leberperfusionen ermöglichen eine umfassende Analyse des Leberstoffwechsels unter Verwendung von Kernspinresonanz (NMR) unter Ernährungsbedingungen, die streng kontrolliert werden können. Da In-silico-Simulationen nach wie vor ein primär theoretisches Mittel zur Beurteilung von Hormonwirkungen und den Auswirkungen pharmazeutischer Interventionen sind, bleibt die durchblutete Leber eines der wertvollsten Testumgebungen für das Verständnis des Leberstoffwechsels. Da diese Studien grundlegende Einblicke in die Leberphysiologie geben, müssen die Ergebnisse genau und reproduzierbar sein. Der größte Faktor für die Reproduzierbarkeit der Ex-vivo-Leberperfusion ist die Qualität der Operation. Daher haben wir eine organisierte und optimierte Methode eingeführt, um Ex-vivo-Mausleberperfusionen im Rahmen von In-situ-NMR-Experimenten durchzuführen. Wir beschreiben auch eine einzigartige Anwendung und diskutieren häufige Probleme, die in diesen Studien aufgetreten sind. Der übergeordnete Zweck besteht darin, einen unkomplizierten Leitfaden für eine Technik zu geben, die wir über mehrere Jahre verfeinert haben und die wir als den goldenen Standard für die Erzielung reproduzierbarer Ergebnisse bei Leberresektionen und Perfusionen im Rahmen von In-situ-NMR-Experimenten betrachten. Der Abstand zum Zentrum des Feldes für den Magneten sowie die Unzugänglichkeit des Gewebes für Eingriffe während des NMR-Experiments machen unsere Methoden neuartig.

Introduction

Ex-vivo-Perfusionen sind entscheidend für die Untersuchung des Leberstoffwechsels, und die Perfusion durch die Pfortader ist der Standard für diese Studien. Um den Leberstoffwechsel isoliert zu untersuchen, muss die Leber aus dem Körper heraus reseziert werden, um Komplikationen zu vermeiden, die sich aus dem Stoffwechsel in anderen Organen (d.h. dem Ganzkörperstoffwechsel) ergeben, und um die Hormonverfügbarkeit (Insulin, Glucagon usw.) zu kontrollieren. Dieser Ansatz kann für das Verständnis der Auswirkungen von Krankheiten wie Diabetes, NAFLD und NASH auf den Leberstoffwechsel sowie für Mechanismen der Arzneimittelwirkung unerlässlich sein. Dieser Artikel dient als Leitfaden für die hepatische Resektion und Perfusion. Wir haben ein optimiertes Verfahren entwickelt, um diese metabolischen Leberstudien mit ausreichender Strenge und Reproduzierbarkeit durchzuführen. Wird die Operation nicht korrekt durchgeführt, kommt es zu einer ausgeprägten Variabilität der erhaltenen Stoffwechseldaten. Wir beschreiben eine organisierte Methode zur Durchführung von Portalvenenkatheterisierung und Leberresektion im Rahmen von Stoffwechselstudien in situ in einem Kernspinresonanzspektrometer (NMR), wie in der Literatur 1,2,3,4,5 beschrieben.

Derzeit gibt es keine Literatur, die eine ex vivo hepatische Perfusion unter Verwendung einer Glassäule innerhalb einer NMR beschreibt. Es gibt auch keine Video- oder Textpublikation, die ein klares Beispiel dafür liefert, wie das Verfahren mit der Mausleber durchgeführt wird, insbesondere um zu demonstrieren, wie man die Pfortader katheterisiert, eine Leber reseziert, überträgt und die Leber an eine Glassäule hängt. Da die gentechnisch veränderte Maus allgegenwärtig zur Untersuchung des Leberstoffwechsels eingesetzt wird, ist dies ein wesentliches Verfahren, das eine vollständige Beschreibung verdient. Leberperfusionsoperationen sind nicht neu, aber dieser Artikel ist eine Goldstandardmethode, begleitet von einem Video, das die in diesem Papier beschriebene technische Exzellenz demonstriert, um allen zu helfen, die an diesem Verfahren interessiert sind. Die hier vorgestellte Methode würde am besten auf den Echtzeitstoffwechsel angewendet werden, um die Funktion und den Umsatz von Metaboliten in Krankheitsmodellen nachzuweisen.

Diese Methode verwendet eine 100 cm große, wasserummantelte Glassäule, die es der Leber ermöglicht, am Boden der Kanüle zu hängen, die durch Perfusat in einem NMR-Röhrchen eingekapselt ist. Erhitztes Wasser im Glasmantel wird verwendet, um die perfusatierte Temperatur zu kontrollieren. Ein dünnschichtiger Oxygenator wird zur pH-Kontrolle mit 95%/5% O 2/CO2 unter Druck gesetzt. Durch die Verwendung von drei separaten Pumpen wird die perfusate Säulenhöhe eingestellt, die der Leber einen konstanten Druck verleiht. Durchflussraten werden nicht über die Anwendung von konstantem Druck hinaus gesteuert (Abbildung 1). Um zu bestätigen, dass die Leber richtig funktioniert, werden Sauerstoffmessungen zusammen mit den Durchflussraten durchgeführt. In unseren Händen führt diese Reihe von Voraussetzungen zu hochgradig wiederholbaren NMR-Experimenten zur Beurteilung der Stoffwechselfunktion der Leber.

Protocol

Experimente mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Florida (Protokollnummer # 201909320) durchgeführt. Der verwendete Mausstamm war C57BL/6J; Alle Mäuse waren männlich. Diese Methode ist im Allgemeinen auch für Studien mit anderen Standard-Mausstämmen anwendbar. Diese Operation wird optimal von zwei Personen durchgeführt, die zusammenarbeiten. 1. Ersteinrichtung Perfuse-Lebern mit perfusathal…

Representative Results

Die Leberfunktion wird in erster Linie durch den Sauerstoffverbrauch und die Durchflussrate beurteilt. Ein Durchfluss von 4-8 ml/min und ein Sauerstoffverbrauch von 1 μmol/min.g sind typisch. Diese Maßnahmen variieren je nach spezifischen Versuchsbedingungen und biologischen Unterschieden. Die genaue Menge des verwendeten Isoflurans hängt von der Art des verwendeten Anästhesiesystems sowie der Umgebung und dem Alter / Gewicht der Maus ab. Während der Operation ändern sich das Isofluran u…

Discussion

Dieser chirurgische Eingriff ist eine Herausforderung und erfordert umfangreiche Übungen, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Isofluran und Trägergas sollten bei Bedarf angepasst werden, um die Lebensfähigkeit des Tieres während des chirurgischen Eingriffs so weit wie möglich zu erhalten. Umwelt, Tageszeit, Alter, Gewicht und einige andere Faktoren beeinflussen die Anästhesie. Gewicht, Ernährung, Stamm der Mäuse und Alter könnten die Operation beeinflussen, da der Fettaufbau die Visualisierung der Pfortad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung der National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889) unterstützt. Ein Teil dieser Arbeit wurde im McKnight Brain Institute an der Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility des National High Magnetic Field Laboratory durchgeführt, die von der National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 und der Bundesstaat Florida.

Materials

1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe N/A N/A Non-specific Brand
100 cm Water Jacketed Glass Column N/A N/A Custom Made
2-0 Silk Suture Braintree Scientific N/A
22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety Terumo SRFF2225
23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles Exel International 26407
27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles Exel International 26426
4×4 in. Surgical Platform N/A N/A Custom Made
70% Alcohol Wipe N/A N/A Non-specific Brand
Circulating Water Bath MS Lauda N/A Model no longer manufactured
Cotton Tip Applicator N/A N/A Non-specific Brand
Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " Roboz RS-6702
Dumont #5/45 Forceps Fine Scientific Tools 11251-35
Dumont #7 – Fine Forceps Fine Scientific Tools 11274-20
Hemostats Fine Scientific Tools 13015-14
Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL RX Generics 71288-0402-02
Isoflurane Patterson Veterinary 14043-0704-06
Lidocaine HCl 2% VEDCO Inc. 50989-0417-12
Membrane-Thin-Layer Oxygenator Radnoti N/A
Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " Roboz RS-6013
Oxygen Meter System Hanstech Instruments Ltd. N/A
Saline 0.9% Solution N/A N/A Saline is made in lab
Scale N/A N/A Non-specific Brand
 Variable Speed Analog Console Pump Systems Cole Palmer N/A Models are custom per application
Weigh boats N/A N/A Non-specific Brand

References

  1. Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
  2. Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
  3. Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
  4. Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
  5. Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
  6. Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
  7. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
  8. Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
  9. Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
  10. Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
  11. Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
  12. . Medical Dictionary Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022)
  13. Thorpe, D. R. . A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep’s Brain). , (1968).
  14. Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  15. . Operations Manual Setup, Installation and Maintenance Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006)
  16. . Heparin Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022)
  17. Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).

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Cite This Article
Giacalone, A. G., Merritt, M. E., Ragavan, M. Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse. J. Vis. Exp. (181), e63154, doi:10.3791/63154 (2022).

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