السابقين فيفو التروية الكبدية من خلال الوريد البابي في الماوس
Summary
يصف البروتوكول طريقة مباشرة لاستئصال كبد الفأر السليم للدراسات الأيضية من خلال تروية الوريد البابي.
Abstract
أصبحت الأمراض الأيضية مثل مرض السكري ، وما قبل السكري ، ومرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) ، والتهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) شائعة بشكل متزايد. تسمح عمليات تروية الكبد خارج الجسم الحي بإجراء تحليل شامل لعملية التمثيل الغذائي للكبد باستخدام الرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، في الظروف الغذائية التي يمكن التحكم فيها بدقة. كما هو الحال في محاكاة سيليكو لا تزال وسيلة نظرية في المقام الأول لتقييم الإجراءات الهرمونية وآثار التدخل الصيدلاني، والكبد perfed لا تزال واحدة من أسرة الاختبار الأكثر قيمة لفهم التمثيل الغذائي الكبدي. نظرا لأن هذه الدراسات توجه الأفكار الأساسية في فسيولوجيا الكبد ، يجب أن تكون النتائج دقيقة وقابلة للتكرار. أكبر عامل في تكرار التروية الكبدية خارج الجسم الحي هو جودة الجراحة. لذلك ، أدخلنا طريقة منظمة ومبسطة لإجراء عمليات تروية كبد الفئران خارج الجسم الحي في سياق تجارب الرنين المغناطيسي النووي في الموقع . كما نصف تطبيقا فريدا ونناقش المشكلات الشائعة التي تمت مواجهتها في هذه الدراسات. الغرض العام هو توفير دليل غير معقد لتقنية قمنا بتحسينها على مدى عدة سنوات والتي نعتبرها المعيار الذهبي للحصول على نتائج قابلة للتكرار في عمليات استئصال الكبد والتروية في سياق تجارب الرنين المغناطيسي النووي في الموقع . المسافة إلى مركز المجال للمغناطيس وكذلك عدم إمكانية وصول الأنسجة إلى التدخل أثناء تجربة الرنين المغناطيسي النووي تجعل أساليبنا جديدة.
Introduction
تعتبر التروية خارج الجسم الحي حاسمة في دراسة التمثيل الغذائي الكبدي ، والتروية من خلال الوريد البابي هو المعيار لهذه الدراسات. من أجل دراسة التمثيل الغذائي الكبدي بمعزل عن الآخرين ، يجب استئصال الكبد من الجسم لتجنب المضاعفات الناشئة عن التمثيل الغذائي في الأعضاء الأخرى (أي التمثيل الغذائي للجسم كله) وممارسة السيطرة على توافر الهرمونات (الأنسولين ، الجلوكاجون ، إلخ). يمكن أن يكون هذا النهج ضروريا لفهم آثار أمراض مثل السكري و NAFLD و NASH على التمثيل الغذائي الكبدي وكذلك آليات عمل الدواء. هذه المقالة بمثابة دليل لاستئصال الكبد والتروية. لقد طورنا إجراء مبسطا لإجراء دراسات الكبد الأيضية هذه بدقة كافية وقابلية للتكرار. إذا لم يتم إجراء الجراحة بشكل صحيح ، فهناك تباين واضح في البيانات الأيضية التي تم الحصول عليها. نحن نصف طريقة منظمة لإجراء قسطرة الوريد البابي واستئصال الكبد في سياق الدراسات الأيضية في الموقع في مطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، كما هو موضح في الأدبيات1،2،3،4،5.
حاليا ، لا توجد أدبيات تصف تروية كبدية خارج الجسم الحي باستخدام عمود زجاجي داخل الرنين المغناطيسي النووي. كما لا يوجد فيديو أو منشور نصي يقدم مثالا واضحا على كيفية تنفيذ الإجراء مع كبد الفأر ، على وجه التحديد ، يوضح كيفية قسطرة الوريد البابي ، واستئصال الكبد ، ونقله ، وتعليقه على عمود زجاجي. نظرا لأن الفأر المعدل وراثيا يستخدم في كل مكان لدراسة استقلاب الكبد ، فهذا إجراء أساسي يستحق وصفا كاملا. جراحات تروية الكبد ليست جديدة ، ولكن هذه المقالة هي طريقة قياسية ذهبية مصحوبة بمقطع فيديو يوضح التميز التقني الموصوف في هذه الورقة لمساعدة جميع المهتمين بهذا الإجراء. من الأفضل تطبيق الطريقة المعروضة هنا على التمثيل الغذائي في الوقت الفعلي للكشف عن وظيفة ودوران المستقلبات في نماذج الأمراض.
تستخدم هذه الطريقة عمودا زجاجيا مغطى بالماء يبلغ طوله 100 سم ، مما يسمح للكبد بالتعليق في الجزء السفلي من القنية المغلفة بواسطة النفخ داخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. يتم استخدام الماء الساخن في السترة الزجاجية للتحكم في درجة حرارة العطر. يتم ضغط الأوكسجين ذو الطبقة الرقيقة بنسبة 95٪ / 5٪ O 2 / CO2 للتحكم في درجة الحموضة. باستخدام ثلاث مضخات منفصلة ، يتم ضبط ارتفاع عمود perfusate ، مما يوفر ضغطا ثابتا على الكبد. لا يتم التحكم في معدلات التدفق خارج نطاق تطبيق الضغط الثابت (الشكل 1). للتأكد من أن الكبد يعمل بشكل مناسب ، يتم أخذ قياسات الأكسجين جنبا إلى جنب مع معدلات التدفق. في أيدينا ، تؤدي هذه المجموعة من الشروط المسبقة إلى تجارب NMR قابلة للتكرار للغاية لتقييم وظيفة التمثيل الغذائي للكبد.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا الإجراء الجراحي صعب ويتطلب ممارسة واسعة النطاق لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. يجب تعديل الإيسوفلوران والغاز الناقل حسب الحاجة للحفاظ على صلاحية الحيوان من خلال أكبر قدر ممكن من الإجراء الجراحي. البيئة والوقت من اليوم والعمر والوزن والعديد من العوامل الأخرى ستؤثر على التخدير. يمكن أن يؤ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R01-DK105346 ، P41-GM122698 ، 5U2C-DK119889). تم تنفيذ جزء من هذا العمل في معهد McKnight Brain Institute في مرفق التصوير بالرنين المغناطيسي المتقدم والتحليل الطيفي (AMRIS) التابع للمختبر الوطني للمجال المغناطيسي العالي ، والذي تدعمه الاتفاقية التعاونية لمؤسسة العلوم الوطنية رقم . DMR-1644779 وولاية فلوريدا.
Materials
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4×4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- . Medical Dictionary Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022)
- Thorpe, D. R. . A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep’s Brain). , (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- . Operations Manual Setup, Installation and Maintenance Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006)
- . Heparin Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022)
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
