Ex Vivo Перфузия печени через воротную вену у мыши
Summary
Протокол описывает простой метод резекции интактной печени мыши для метаболических исследований посредством перфузии воротных вен.
Abstract
Метаболические заболевания, такие как диабет, преддиабет, неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) и неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), становятся все более распространенными. Перфузии печени ex vivo позволяют проводить комплексный анализ метаболизма печени с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в условиях питания, которые можно строго контролировать. Поскольку в silico моделирование остается в первую очередь теоретическим средством оценки гормональных действий и эффектов фармацевтического вмешательства, перфузированная печень остается одним из самых ценных испытательных стендов для понимания печеночного метаболизма. Поскольку эти исследования направляют базовое понимание физиологии печени, результаты должны быть точными и воспроизводимыми. Наибольшим фактором воспроизводимости печеночной перфузии ex vivo является качество хирургического вмешательства. Поэтому мы ввели организованный и оптимизированный метод выполнения перфузий печени мышей ex vivo в контексте экспериментов с ЯМР in situ . Мы также описываем уникальное приложение и обсуждаем общие проблемы, возникающие в этих исследованиях. Общая цель состоит в том, чтобы предоставить несложное руководство по технике, которую мы усовершенствовали в течение нескольких лет, которую мы считаем золотым стандартом для получения воспроизводимых результатов в печеночных резекциях и перфузиях в контексте экспериментов in situ ЯМР. Расстояние до центра поля для магнита, а также недоступность ткани для вмешательства во время эксперимента ЯМР делает наши методы новыми.
Introduction
Перфузии ex vivo имеют решающее значение в изучении печеночного метаболизма, и перфузия через воротную вену является стандартом для этих исследований. Чтобы изучать печеночный обмен в изоляции, печень должна быть резецирована из организма, чтобы избежать осложнений, возникающих в результате метаболизма в других органах (т. Е. Метаболизм всего тела) и осуществлять контроль над доступностью гормонов (инсулин, глюкагон и т. Д.). Этот подход может иметь важное значение для понимания влияния таких заболеваний, как диабет, НАЖБП и НАСГ, на печеночный метаболизм, а также механизмов действия лекарств. Эта статья служит руководством по печеночной резекции и перфузии. Мы разработали упрощенную процедуру для выполнения этих метаболических исследований печени с достаточной строгостью и воспроизводимостью. Если операция выполнена неправильно, наблюдается выраженная вариабельность полученных метаболических данных. Описан организованный метод выполнения портальной катетеризации вен и резекции печени в контексте метаболических исследований in situ в спектрометре ядерного магнитного резонанса (ЯМР), описанный в литературе 1,2,3,4,5.
В настоящее время нет литературы, описывающей перфузию печени ex vivo с использованием стеклянной колонки в ЯМР. Также нет видео или текстовой публикации, предоставляющей четкий пример того, как выполнять процедуру с печенью мыши, в частности, демонстрирующей, как катетеризировать воротную вену, резецировать печень, переносить и вешать печень на стеклянную колонку. Поскольку генетически модифицированная мышь повсеместно используется для изучения метаболизма печени, это важная процедура, которая заслуживает полного описания. Операции по перфузии печени не новы, но эта статья является методом золотого стандарта, сопровождаемым видео, демонстрирующим техническое совершенство, описанное в этой статье, чтобы помочь всем, кто заинтересован в этой процедуре. Метод, представленный здесь, лучше всего применять к метаболизму в режиме реального времени для обнаружения функции и оборота метаболитов в моделях заболеваний.
Этот метод использует стеклянную колонку с водяной рубашкой длиной 100 см, которая позволяет печени висеть на дне канюли, инкапсулированной перфусатом внутри ЯМР-трубки. Нагретая вода в стеклянной рубашке используется для контроля температуры перфусата. Тонкослойный оксигенатор находится под давлением с 95%/5% O2/CO2 для контроля pH. С помощью трех отдельных насосов устанавливается высота колонны перфусата, которая обеспечивает постоянное давление на печень. Расход не контролируется сверх приложения постоянного давления (рисунок 1). Чтобы подтвердить, что печень функционирует надлежащим образом, измерения кислорода проводятся вместе со скоростью потока. В наших руках этот набор предварительных условий приводит к высоковоспроизводимым экспериментам ЯМР для оценки метаболической функции печени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта хирургическая процедура является сложной и требует обширной практики для достижения воспроизводимых результатов. Изофлуран и газ-носитель должны быть отрегулированы по мере необходимости, чтобы поддерживать жизнеспособность животного на протяжении большей части хирургической …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансированием Национальных институтов здравоохранения (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Часть этой работы была выполнена в Институте мозга Макнайта в Центре передовой магнитно-резонансной томографии и спектроскопии (AMRIS) Национальной лаборатории магнитного поля, который поддерживается Соглашением о сотрудничестве Национального научного фонда No. DMR-1644779 и штат Флорида.
Materials
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4×4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- . Medical Dictionary Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022)
- Thorpe, D. R. . A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep’s Brain). , (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- . Operations Manual Setup, Installation and Maintenance Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006)
- . Heparin Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022)
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
