Ex Vivo Perfusão hepática através do Portal Veia em Rato
Summary
O protocolo descreve um método simples de ressecção de um fígado de rato intacto para estudos metabólicos através da perfusão venosa portal.
Abstract
Doenças metabólicas como diabetes, pré-diabetes, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) e esteatohepatite não alcoólica (NASH) estão se tornando cada vez mais comuns. Perfusões hepáticas ex vivo permitem uma análise abrangente do metabolismo hepático usando ressonância magnética nuclear (RMN), em condições nutricionais que podem ser rigorosamente controladas. Como nas simulações de silico permanecem um meio principalmente teórico de avaliar as ações hormonais e os efeitos da intervenção farmacêutica, o fígado perfumado continua sendo um dos leitos de teste mais valiosos para a compreensão do metabolismo hepático. Como esses estudos orientam insights básicos sobre fisiologia hepática, os resultados devem ser precisos e reprodutíveis. O maior fator na reprodutibilidade da perfusão hepática ex vivo é a qualidade da cirurgia. Por isso, introduzimos um método organizado e simplificado para realizar perfusões de fígado de camundongos ex vivo no contexto de experimentos in situ NMR. Descrevemos também uma aplicação única e discutimos questões comuns encontradas nesses estudos. O objetivo geral é fornecer um guia descomplicado para uma técnica que refinamos ao longo de vários anos que consideramos o padrão dourado para obter resultados reprodutíveis em ressecções hepáticas e perfusões no contexto de experimentos in situ NMR. A distância até o centro do campo para o ímã, bem como a inacessibilidade do tecido à intervenção durante o experimento NMR torna nossos métodos novos.
Introduction
Perfusões ex vivo são cruciais no estudo do metabolismo hepático, e a perfusão pela veia portal é o padrão para esses estudos. Para estudar o metabolismo hepático isoladamente, o fígado deve ser ressecado do corpo para evitar complicações decorrentes do metabolismo em outros órgãos (ou seja, metabolismo do corpo inteiro) e exercer controle sobre a disponibilidade hormonal (insulina, glucagon, etc.). Essa abordagem pode ser essencial para entender os efeitos de doenças como diabetes, NAFLD e NASH no metabolismo hepático, bem como mecanismos de ação medicamentosa. Este artigo serve como um guia para ressecção hepática e perfusão. Desenvolvemos um procedimento simplificado para realizar esses estudos hepáticos metabólicos com rigor e reprodutibilidade suficientes. Se a cirurgia não for realizada corretamente, há variabilidade pronunciada nos dados metabólicos obtidos. Descrevemos um método organizado para realizar cateterismo venoso portal e ressecção hepática no contexto de estudos metabólicos in situ em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN), conforme descrito na literatura 1,2,3,4,5.
Atualmente, não há literatura descrevendo uma perfusão ex vivo hepática usando uma coluna de vidro dentro de uma RMN. Também não há uma publicação de vídeo ou texto que forneça um exemplo claro de como realizar o procedimento com o fígado do rato, especificamente, demonstrando como cateterizar a veia do portal, ressecar um fígado, transferir e pendurar o fígado em uma coluna de vidro. Como o camundongo geneticamente modificado é onipresentemente usado para estudar o metabolismo hepático, este é um procedimento essencial que merece uma descrição completa. As cirurgias de perfusão hepática não são novas, mas este artigo é um método padrão-ouro acompanhado de um vídeo demonstrando a excelência técnica descrita neste artigo para ajudar todos os interessados neste procedimento. O método aqui apresentado seria melhor aplicado ao metabolismo em tempo real para detectar a função e a rotatividade de metabólitos em modelos de doenças.
Este método usa uma coluna de vidro de 100 cm com jaqueta de água, que permite que o fígado fique pendurado na parte inferior da cânula encapsulada por perfusato dentro de um tubo NMR. A água aquecida na jaqueta de vidro é usada para controlar a temperatura perfusada. Um oxigenador de camada fina é pressurizado com 95%/5% O2/CO2 para controle de pH. Usando três bombas separadas, a altura da coluna perfusada é definida, o que proporciona pressão constante ao fígado. As taxas de fluxo não são controladas além da aplicação de pressão constante (Figura 1). Para confirmar que o fígado está funcionando adequadamente, as medidas de oxigênio são tomadas juntamente com as taxas de fluxo. Em nossas mãos, este conjunto de pré-condições leva a experimentos de RMN altamente repetitivos para a avaliação da função metabólica hepática.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimento cirúrgico é desafiador e requer uma prática extensiva para alcançar resultados reprodutíveis. O gás isoflurane e portador deve ser ajustado conforme necessário para manter a viabilidade do animal através da maior parte do procedimento cirúrgico possível. Ambiente, hora do dia, idade, peso e vários outros fatores afetarão a anestesia. Peso, dieta, variedade de camundongos e idade podem afetar a cirurgia, pois o acúmulo de gordura pode interferir na visualização da veia portal. Ao bater as …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Uma parte deste trabalho foi realizada no McKnight Brain Institute no National High Magnetic Laboratory’s Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy Facility (AMRIS), que é apoiado pelo National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 e o Estado da Flórida.
Materials
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4×4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
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