Summary

Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

Published: September 09, 2021
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Summary

La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica esencial responsable de generar energía en muchos tipos de células diferentes, incluidos los hepatocitos. Aquí, describimos un método para medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios recién aislados utilizando ácido palmítico marcado con 14C.

Abstract

La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica clave para satisfacer las demandas de energía del hígado y proporcionar sustratos y cofactores para procesos adicionales, como la cetogénesis y la gluconeogénesis, que son esenciales para mantener la homeostasis de la glucosa de todo el cuerpo y apoyar la función de los órganos extrahepáticos en el estado de ayuno. La β oxidación de ácidos grasos ocurre dentro de las mitocondrias y los peroxisomas y se regula a través de múltiples mecanismos, incluida la absorción y activación de ácidos grasos, los niveles de expresión enzimática y la disponibilidad de cofactores como la coenzima A y NAD +. En los ensayos que miden la β oxidación de ácidos grasos en homogeneizados hepáticos, la lisis celular y la adición común de niveles suprafisiológicos de cofactores enmascaran los efectos de estos mecanismos reguladores. Además, la integridad de los orgánulos en los homogeneizados es difícil de controlar y puede variar significativamente entre preparaciones. La medición de la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios intactos supera las trampas anteriores. Este protocolo describe un método para la medición de la β oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos primarios de ratón recién aislados incubados con ácido palmítico marcado con 14C. Al evitar horas o días de cultivo, este método tiene la ventaja de preservar mejor los niveles de expresión de proteínas y la actividad de la vía metabólica del hígado original, incluida la activación de la β oxidación de ácidos grasos observada en hepatocitos aislados de ratones en ayunas en comparación con ratones alimentados.

Introduction

La β-oxidación de ácidos grasos es un proceso esencial en el metabolismo de los lípidos, proporcionando una vía catabólica para equilibrar la síntesis de ácidos grasos y la ingesta de la dieta. Este proceso genera energía para múltiples órganos, incluidos el músculo cardíaco, la corteza renal y el hígado en ayunas, y utiliza ácidos grasos obtenidos de la dieta, la lipólisis del tejido adiposo y las reservas internas de triglicéridos 1,2.

La oxidación de los ácidos grasos a través de la vía de β-oxidación da como resultado el acortamiento secuencial de la cadena de acilo graso por dos carbonos a la vez, liberados como acetil-CoA, y este proceso ocurre tanto en las mitocondrias como en los peroxisomas. Mientras que la mayoría de los ácidos grasos sufren sólo β-oxidación, algunos se oxidan en diferentes carbonos antes de entrar en esta vía. Por ejemplo, los ácidos grasos sustituidos por 3-metilo, como el ácido fitánico, se someten a la eliminación de un carbono por α-oxidación en los peroxisomas antes de entrar en la vía de β-oxidación. Del mismo modo, algunos ácidos grasos se convierten primero en ácidos grasos dicarboxílicos por oxidación del grupo metilo terminal (ω-oxidación) en el retículo endoplásmico antes de ser oxidados preferentemente en los peroxisomas por β-oxidación3.

Independientemente del orgánulo específico, un ácido graso primero debe convertirse en un tioéster de coenzima A (CoA), o acil-CoA, para oxidarse a través de la vía de β oxidación. β-Oxidación de acil-CoAs de cadena larga en la matriz mitocondrial requiere el transbordador de carnitina para su translocación, donde la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1) cataliza la conversión de acil-CoAs en acilcarnitinas y es la enzima limitante de velocidad en este proceso4. Una vez translocados a la matriz mitocondrial, los acil-CoAs se vuelven a formar y sirven como sustratos para la maquinaria mitocondrial de β-oxidación. En el estado de ayuno, el acetil-CoA producido a través de la β-oxidación en las mitocondrias hepáticas se canaliza principalmente a la cetogénesis. Los peroxisomas sirven como el sitio principal para la β-oxidación de los ácidos grasos de cadena muy larga, cadena ramificada y dicarboxílicos. Los peroxisomas no requieren el transbordador de carnitina para importar sustratos de ácidos grasos, sino que importan los correspondientes acilo-CoAs a través de la actividad de los transportadores de casete de unión a ATP (ABC) ABCD1-35. Dentro de los peroxisomas, los acil-CoAs son oxidados por un conjunto dedicado de enzimas, distintas de la maquinaria de β oxidación de ácidos grasos mitocondriales. Tanto las mitocondrias como los peroxisomas también requieren un suministro de NAD + y CoA libre para oxidar las cadenas de acilo graso. Se ha demostrado que los niveles de CoA en el hígado aumentan en respuesta al ayuno, lo que respalda el aumento de la tasa de oxidación de ácidos grasos que ocurre en este estado6. Además, el aumento de la degradación de CoA en los peroxisomas resulta en una disminución selectiva de la oxidación de ácidos grasos peroxisomales7. Por lo tanto, el proceso de oxidación de ácidos grasos dentro de la célula está regulado por los niveles de expresión y las actividades de las enzimas involucradas en la activación, transporte y oxidación de los ácidos grasos, así como las concentraciones de cofactores y otros metabolitos a través de múltiples compartimentos subcelulares.

Los procedimientos que utilizan homogeneizados de tejidos para medir la oxidación de ácidos grasos destruyen la arquitectura celular que regula y apoya este proceso, lo que lleva a una recopilación de datos que no reflejan con precisión el metabolismo in vivo. Si bien las técnicas que utilizan hepatocitos primarios chapados preservan este sistema, el cultivo de células aisladas durante largos períodos de tiempo resulta en una pérdida del perfil de expresión génica in vivo que estaba presente en las células cuando todavía vivían dentro del animal 8,9. El siguiente protocolo describe un método para aislar los hepatocitos primarios y evaluar su capacidad de β-oxidación de ácidos grasos inmediatamente después del aislamiento y en suspensión, utilizando [1-14C]ácido palmítico. El ensayo se basa en la medición de la radiactividad asociada con los metabolitos solubles en ácido (MAPE) o productos, como el acetil-CoA, producidos por la β-oxidación del ácido palmítico [1-14C]10,11.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales en ratones (C57BL / 6J, machos, 9-11 semanas de edad) fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia Occidental. 1. Aislamiento de hepatocitos Preparación En los días previos al aislamiento de hepatocitos, preparar los tampones y medios de cultivo celular enumerados en la Tabla 1. Configure un baño de agua con la temperatura establecida a 37 ° C c…

Representative Results

La perfusión hepática descrita aquí típicamente produce 30-40 millones de células / hígado con una viabilidad promedio del 80%, según lo estimado por la exclusión del azul de tripano (Figura 2). La concentración típica de glucosa en el tampón Krebs-Henseleit (KHB), que se utiliza para preparar los tampones de perfusión 1 y 2, es de 11 mM. Al medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos aislados de ratones en ayunas, la concentración de glucosa en el KHB se puede reduc…

Discussion

Durante la perfusión hepática, es fundamental evitar la introducción de burbujas de aire, ya que bloquean los microcapilarios en el hígado, impidiendo o restringiendo la circulación tampón y disminuyendo en general el rendimiento y la viabilidad de los hepatocitos20,21. Las precauciones, como inspeccionar de cerca la línea de entrada llena de tampón antes de la canulación del IVC y evitar levantar la línea de entrada del tubo que contiene el tampón 1 p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la subvención R35GM119528 de los Institutos Nacionales de Salud a Roberta Leonardi.

Materials

(R)-(+)-Etomoxir sodium salt Tocris Bioscience 4539/10
[1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL American Radiolabeled Chemicals ARC 0172A
1 M HEPES, sterile Corning 25060CI
10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette Mettler Toledo 17008604
1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips
5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes
50 mL sterile centrifuge tubes CellTreat 229421
70% Perchloric acid Fisher Scientific A2296-1LB
BSA, fatty acid-free Fisher Scientific BP9704100
CaCl2 dihydrate MilliporeSigma 223506
D-(+)-Glucose MilliporeSigma G7021
EGTA Gold Biotechnology E-217
Ethanol Pharmco 111000200CSPP
Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile CellTreat 229707
Gentamicin sulphate Gold Biotechnology G-400-25
HDPE, 6.5 mL scintillation vials Fisher Scientific 03-342-3
Hemocytometer
Hypodermic needles 22 G, 1.5 in BD Biosciences 305156
Isoflurane VetOne 502017
KCl Fisher Scientific BP366-1
KH2PO4 MilliporeSigma P5655
Liberase TM Research Grade MilliporeSigma 5401119001 Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin
M199 medium MilliporeSigma M5017
MgSO4 heptahydrate MilliporeSigma M1880
Microcentrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17
Microdissecting Scissors Roboz Surgical Instrument Co RS-5980
NaCl Chem-Impex International 30070
NaHCO3 Acros Organics 424270010
Palmitic acid MilliporeSigma P0500
Penicillin/streptomycin (100x) Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Cytiva Life Sciences SH30256.01
Positive displacement pipette MR-10, 10 µL Mettler Toledo 17008575
Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes Eppendorf 5810 R
Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes Fisher Scientific 14-956-9A
Scintillation counter Perkin Elmer TriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD cocktail Fisher Scientific SX18-4
Shaking water bath, 30 L capacity New Brunswick Scientific  Model G76
Sterile cell strainers, 100 µm Fisher Scientific 22363549
Thumb Dressing Forceps Roboz Surgical Instrument Co RS-8120
Trypan Blue Corning 25900CI
Variable-flow peristaltic pump Fisher Scientific 138762
Water baths, 2–2.5 L capacity

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Vickers, S. D., Saporito, D. C., Leonardi, R. Measurement of Fatty Acid β-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes. J. Vis. Exp. (175), e62904, doi:10.3791/62904 (2021).

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