Misurazione della β-ossidazione degli acidi grassi in una sospensione di epatociti di topo appena isolati
Summary
L’β-ossidazione degli acidi grassi è una via metabolica essenziale responsabile della generazione di energia in molti tipi di cellule diverse, compresi gli epatociti. Qui, descriviamo un metodo per misurare l’β-ossidazione degli acidi grassi in epatociti primari appena isolati utilizzando acido palmitico marcato con 14C.
Abstract
L’β-ossidazione degli acidi grassi è una via metabolica chiave per soddisfare le richieste energetiche del fegato e fornire substrati e cofattori per processi aggiuntivi, come la chetogenesi e la gluconeogenesi, che sono essenziali per mantenere l’omeostasi del glucosio in tutto il corpo e supportare la funzione extra-epatica degli organi nello stato a digiuno. La β-ossidazione degli acidi grassi avviene all’interno dei mitocondri e dei perossisomi ed è regolata attraverso molteplici meccanismi, tra cui l’assorbimento e l’attivazione degli acidi grassi, i livelli di espressione enzimatica e la disponibilità di cofattori come il coenzima A e NAD +. Nei saggi che misurano la β-ossidazione degli acidi grassi negli omogeneizzati epatici, la lisi cellulare e l’aggiunta comune di livelli soprafisiologici di cofattori mascherano gli effetti di questi meccanismi regolatori. Inoltre, l’integrità degli organelli negli omogeneizzati è difficile da controllare e può variare significativamente tra i preparati. La misurazione dell’β-ossidazione degli acidi grassi negli epatociti primari intatti supera le insidie di cui sopra. Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione dell’ossidazione β degli acidi grassi in una sospensione di epatociti primari di topo appena isolati incubati con acido palmitico marcato con 14C. Evitando ore o giorni di coltura, questo metodo ha il vantaggio di preservare meglio i livelli di espressione proteica e l’attività della via metabolica del fegato originale, compresa l’attivazione della β-ossidazione degli acidi grassi osservata negli epatociti isolati da topi a digiuno rispetto ai topi nutriti.
Introduction
L’β-ossidazione degli acidi grassi è un processo essenziale nel metabolismo dei lipidi, fornendo un percorso catabolico per bilanciare la sintesi e l’assunzione di acidi grassi dalla dieta. Questo processo genera energia per più organi, tra cui il muscolo cardiaco, la corteccia renale e il fegato a digiuno, e utilizza acidi grassi ottenuti dalla dieta, lipolisi del tessuto adiposo e depositi interni di trigliceridi 1,2.
L’ossidazione dell’acido grasso attraverso la via β-ossidazione provoca l’accorciamento sequenziale della catena acilica grassa di due carboni alla volta, rilasciati come acetil-CoA, e questo processo si verifica sia nei mitocondri che nei perossisomi. Mentre la maggior parte degli acidi grassi subisce solo β-ossidazione, alcuni vengono ossidati a diversi carboni prima di entrare in questo percorso. Ad esempio, gli acidi grassi 3-metil-sostituiti, come l’acido fitanico, subiscono la rimozione di un carbonio mediante α-ossidazione nei perossisomi prima di entrare nella via di β-ossidazione. Allo stesso modo, alcuni acidi grassi vengono prima convertiti in acidi grassi dicarbossilici mediante ossidazione del gruppo metilico terminale (ω-ossidazione) nel reticolo endoplasmatico prima di essere ossidati preferenzialmente nei perossisomi da β-ossidazione3.
Indipendentemente dall’organello specifico, un acido grasso deve prima essere convertito in un tioestere coenzima A (CoA), o acil-CoA, per essere ossidato attraverso la via di β-ossidazione. β-ossidazione degli acil-CoA a catena lunga nella matrice mitocondriale richiede la navetta carnitina per la loro traslocazione, dove la carnitina palmitoiltransferasi 1 (CPT1) catalizza la conversione degli acil-CoA in acilcarnitine ed è l’enzima limitante la velocità in questo processo4. Una volta traslocati nella matrice mitocondriale, gli acil-CoA vengono riformati e fungono da substrati per il meccanismo di β-ossidazione mitocondriale. Nello stato a digiuno, l’acetil-CoA prodotto attraverso β-ossidazione nei mitocondri epatici è principalmente incanalato alla chetogenesi. I perossisomi fungono da sito primario per la β-ossidazione degli acidi grassi a catena molto lunga, a catena ramificata e dicarbossilici. I perossisomi non richiedono la navetta carnitina per importare substrati di acidi grassi, ma importano i corrispondenti acil-CoA attraverso l’attività dei trasportatori a cassetta legante ATP (ABC) ABCD1-35. All’interno dei perossisomi, gli acil-CoA vengono quindi ossidati da un insieme dedicato di enzimi, distinti dal meccanismo di β-ossidazione degli acidi grassi mitocondriali. Sia i mitocondri che i perossisomi richiedono anche un apporto di NAD+ e CoA libero per ossidare le catene aciliche grasse. I livelli di CoA nel fegato hanno dimostrato di aumentare in risposta al digiuno, sostenendo l’aumento del tasso di ossidazione degli acidi grassi che si verifica in questo stato6. Inoltre, l’aumento della degradazione del CoA nei perossisomi si traduce in una diminuzione selettiva dell’ossidazione degli acidi grassi perossisomali7. Pertanto, il processo di ossidazione degli acidi grassi all’interno della cellula è regolato dai livelli di espressione e dalle attività degli enzimi coinvolti nell’attivazione, nel trasporto e nell’ossidazione degli acidi grassi, nonché dalle concentrazioni di cofattori e altri metaboliti in più compartimenti subcellulari.
Le procedure che utilizzano gli omogeneizzati tissutali per misurare l’ossidazione degli acidi grassi distruggono l’architettura cellulare che regola e supporta questo processo, portando a una raccolta di dati che non riflette accuratamente il metabolismo in vivo. Mentre le tecniche che utilizzano epatociti primari placcati preservano questo sistema, la coltura di cellule isolate per lunghi periodi di tempo comporta una perdita del profilo di espressione genica in vivo che era presente nelle cellule quando vivevano ancora all’interno dell’animale 8,9. Il seguente protocollo descrive un metodo per isolare gli epatociti primari e dosare la loro capacità di β-ossidazione degli acidi grassi immediatamente dopo l’isolamento e in sospensione, utilizzando acido [1-14C]palmitico. Il test si basa sulla misurazione della radioattività associata ai metaboliti acidosolubili (ASM) o a prodotti, come l’acetil-CoA, prodotti dalla β-ossidazione dell’acido [1-14C]palmitico10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la perfusione epatica, è fondamentale evitare l’introduzione di bolle d’aria, in quanto bloccano i microcapillari nel fegato, impedendo o limitando la circolazione tampone e diminuendo complessivamente la resa e la vitalità degli epatociti20,21. Precauzioni, come l’ispezione ravvicinata della linea di ingresso riempita di tampone prima della cannulazione dell’IVC ed evitare di sollevare la linea di ingresso dal tubo contenente buffer 1 per passare al bu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health grant R35GM119528 a Roberta Leonardi.
Materials
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
References
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
- Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
- Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
- Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107 (2010).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
- Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
- Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).
- Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).
- Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).
- Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
- Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
- Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
- Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528 (2008).
- Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
- Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
