Summary

Medição do ácido graxo β-oxidação em uma suspensão de hepatócitos de rato recém-isolados

Published: September 09, 2021
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Summary

O ácido graxo β-oxidação é uma via metabólica essencial responsável pela geração de energia em muitos tipos diferentes de células, incluindo hepatócitos. Aqui, descrevemos um método para medir o ácido graxo β-oxidação em hepatócitos primários recém-isolados usando ácido palmítico de 14C.

Abstract

O ácido graxo β-oxidação é um caminho metabólico fundamental para atender às demandas energéticas do fígado e fornecer substratos e cofatores para processos adicionais, como cetogênese e gliconeogênese, que são essenciais para manter a homeostase de glicose do corpo inteiro e apoiar a função de órgãos extra-hepáticos no estado de jejum. O β-oxidação do ácido graxo ocorre dentro das mitocôndrias e peroxismos e é regulado através de múltiplos mecanismos, incluindo a absorção e ativação de ácidos graxos, níveis de expressão enzime e disponibilidade de cofatores como a coenzima A e NAD+. Em ensaios que medem o ácido graxo β-oxidação em homogeneizadores hepáticos, a lise celular e a adição comum de níveis suprafisiológicos de cofatores mascaram os efeitos desses mecanismos regulatórios. Além disso, a integridade das organelas nos homogeneizadores é difícil de controlar e pode variar significativamente entre as preparações. A medição do ácido graxo β-oxidação em hepatócitos primários intactos supera as armadilhas acima. Este protocolo descreve um método para a medição do ácido graxo β-oxidação em uma suspensão de hepatócitos de camundongos primários recém-isolados incubados com ácido palmítico de 14C. Ao evitar horas a dias de cultura, este método tem a vantagem de preservar melhor os níveis de expressão proteica e a atividade da via metabólica do fígado original, incluindo a ativação do ácido graxo β-oxidação observado em hepatócitos isolados de camundongos em jejum em comparação com camundongos alimentados.

Introduction

O ácido graxo β-oxidação é um processo essencial no metabolismo lipídico, fornecendo um caminho catabólico para equilibrar a síntese de ácidos graxos e a ingestão da dieta. Esse processo gera energia para múltiplos órgãos, incluindo o músculo cardíaco, córtex renal e fígado em jejum, e utiliza ácidos graxos obtidos da dieta, lipólise tecidual adiposa e triglicerídeos internos 1,2.

A oxidação do ácido graxo através da via β-oxidação resulta no encurtamento sequencial da cadeia de acilho gorduroso por dois carbonos de cada vez, liberados como acetil-CoA, e esse processo ocorre tanto nas mitocôndrias quanto nos peroxisomes. Enquanto a maioria dos ácidos graxos sofre apenas β-oxidação, alguns são oxidados em diferentes carbonos antes de entrar neste caminho. Por exemplo, ácidos graxos substituídos por 3 metil, como o ácido fistanico, sofrem a remoção de um carbono por α-oxidação nos perosemos antes de entrar na via β-oxidação. Da mesma forma, alguns ácidos graxos são primeiro convertidos em ácidos graxos dicarboxílicos por oxidação do grupo metil terminal (ω-oxidação) no ânticulo endoplasmático antes de serem preferencialmente oxidados nos perosários por β-oxidação3.

Independentemente da organela específica, um ácido graxo deve primeiro ser convertido em um tiaíster aconchego A (CoA), ou acyl-CoA, para ser oxidado através da via β-oxidação. β-Oxidação de Acyl-CoAs de cadeia longa na matriz mitocondrial requer o transporte carnitina para sua translocação, onde a palmitoyltransferase 1 (CPT1) catalisa a conversão de aciila-CoAs para acicarnitinas e é a enzima que limita a taxa neste processo4. Uma vez translocados à matriz mitocondrial, os aciis-CoAs são re-formados e servem como substratos para o maquinário mitocondrial β-oxidação. No estado de jejum, o acetil-CoA produzido através de β-oxidação em mitocôndrias hepáticas é canalizado principalmente para cetogênese. Peroxisomos servem como o local principal para a β-oxidação de ácidos graxos de cadeia muito longa, ramificadas e dicarboxílicos. Os peroxisários não exigem que o transporte de carnitina importe substratos de ácidos graxos, em vez de importar o correspondente acyl-CoAs através da atividade dos transportadores de de ligação ATP (ABC) ABCD1-35. Dentro dos peroxisomes, os acilico-CoAs são então oxidados por um conjunto dedicado de enzimas, distintas do ácido graxo mitocondrial β máquinas de oxidação. Tanto mitocôndrias quanto peroxisomes também requerem um fornecimento de NAD+ e CoA livre para oxidar cadeias de acicila gordurosa. Os níveis de COA no fígado têm mostrado aumento em resposta ao jejum, apoiando o aumento da taxa de oxidação de ácidos graxos que ocorre neste estado6. Além disso, o aumento da degradação do CoA nos peroxisomes resulta em uma diminuição seletiva na oxidação de ácido graxo peroxisomal7. Portanto, o processo de oxidação de ácidos graxos dentro da célula é regulado pelos níveis de expressão e atividades das enzimas envolvidas na ativação, transporte e oxidação de ácidos graxos, bem como as concentrações de cofatores e outros metabólitos em vários compartimentos subcelulares.

Procedimentos que utilizam homogeneizadores teciduais para medir a oxidação de ácidos graxos destroem a arquitetura celular que regula e apoia esse processo, levando a uma coleta de dados que não refletem com precisão o metabolismo in vivo. Enquanto as técnicas que utilizam hepatócitos primários banhados preservam esse sistema, a cultura de células isoladas por longos períodos de tempo resulta em uma perda do perfil de expressão genética in vivo que estava presente nas células quando ainda viviam dentro do animal 8,9. O protocolo a seguir descreve um método para isolar hepatócitos primários e avaliar sua capacidade de ácido graxo β-oxidação imediatamente após o isolamento e na suspensão, usando [1-14C]ácido palmítico. O ensaio baseia-se na medição da radioatividade associada aos metabólitos solúveis ácidos (ASM) ou produtos, como acetil-CoA, produzidos pela β-oxidação do ácido palmítico 10,11.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais em camundongos (C57BL/6J, machos, 9-11 semanas de idade) foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da West Virginia University. 1. Isolamento hepatocito Preparação Nos dias anteriores ao isolamento do hepatocito, prepare os buffers e os meios de cultura celular listados na Tabela 1. Configure um banho de água com temperatura fixada em 37 °C perto de onde a cirurgia será realiza…

Representative Results

A perfusão hepática descrita aqui normalmente produz de 30 a 40 milhões de células/fígado com viabilidade média de 80%, como estimado pela exclusão azul trypan (Figura 2). A concentração típica de glicose no tampão Krebs-Henseleit (KHB), que é usado para preparar os Buffers de perfusão 1 e 2, é de 11 mM. Ao medir o ácido graxo β-oxidação em hepatócitos isolados de camundongos em jejum, a concentração de glicose no KHB pode ser reduzida para representar melhor o estado em…

Discussion

Durante a perfusão hepática, é fundamental evitar a introdução de bolhas de ar, pois bloqueiam os microcapilários do fígado, impedindo ou restringindo a circulação do buffer e diminuindo o rendimento e a viabilidade do hepatocito e da viabilidade20,21. Precauções, como inspecionar de perto a linha de entrada preenchida com buffer antes da cannulação do IVC e evitar tirar a linha de entrada do tubo contendo buffer 1 para mudar para Buffer 2, como desc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela concessão dos Institutos Nacionais de Saúde R35GM119528 a Roberta Leonardi.

Materials

(R)-(+)-Etomoxir sodium salt Tocris Bioscience 4539/10
[1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL American Radiolabeled Chemicals ARC 0172A
1 M HEPES, sterile Corning 25060CI
10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette Mettler Toledo 17008604
1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips
5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes
50 mL sterile centrifuge tubes CellTreat 229421
70% Perchloric acid Fisher Scientific A2296-1LB
BSA, fatty acid-free Fisher Scientific BP9704100
CaCl2 dihydrate MilliporeSigma 223506
D-(+)-Glucose MilliporeSigma G7021
EGTA Gold Biotechnology E-217
Ethanol Pharmco 111000200CSPP
Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile CellTreat 229707
Gentamicin sulphate Gold Biotechnology G-400-25
HDPE, 6.5 mL scintillation vials Fisher Scientific 03-342-3
Hemocytometer
Hypodermic needles 22 G, 1.5 in BD Biosciences 305156
Isoflurane VetOne 502017
KCl Fisher Scientific BP366-1
KH2PO4 MilliporeSigma P5655
Liberase TM Research Grade MilliporeSigma 5401119001 Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin
M199 medium MilliporeSigma M5017
MgSO4 heptahydrate MilliporeSigma M1880
Microcentrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17
Microdissecting Scissors Roboz Surgical Instrument Co RS-5980
NaCl Chem-Impex International 30070
NaHCO3 Acros Organics 424270010
Palmitic acid MilliporeSigma P0500
Penicillin/streptomycin (100x) Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Cytiva Life Sciences SH30256.01
Positive displacement pipette MR-10, 10 µL Mettler Toledo 17008575
Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes Eppendorf 5810 R
Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes Fisher Scientific 14-956-9A
Scintillation counter Perkin Elmer TriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD cocktail Fisher Scientific SX18-4
Shaking water bath, 30 L capacity New Brunswick Scientific  Model G76
Sterile cell strainers, 100 µm Fisher Scientific 22363549
Thumb Dressing Forceps Roboz Surgical Instrument Co RS-8120
Trypan Blue Corning 25900CI
Variable-flow peristaltic pump Fisher Scientific 138762
Water baths, 2–2.5 L capacity

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Vickers, S. D., Saporito, D. C., Leonardi, R. Measurement of Fatty Acid β-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes. J. Vis. Exp. (175), e62904, doi:10.3791/62904 (2021).

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