Summary

Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter Maus-Hepatozyten

Published: September 09, 2021
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Summary

Fettsäure-β-Oxidation ist ein essentieller Stoffwechselweg, der für die Energieerzeugung in vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Hepatozyten, verantwortlich ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung der Fettsäure-β-Oxidation in frisch isolierten primären Hepatozyten unter Verwendung von 14C-markierter Palmitinsäure.

Abstract

Die Fettsäure-β-Oxidation ist ein wichtiger Stoffwechselweg, um den Energiebedarf der Leber zu decken und Substrate und Cofaktoren für zusätzliche Prozesse wie Ketogenese und Glukoneogenese bereitzustellen, die für die Aufrechterhaltung der Ganzkörper-Glukosehomöostase unerlässlich sind und die extrahepatische Organfunktion im nüchternen Zustand unterstützen. Die Fettsäure-β-Oxidation erfolgt in den Mitochondrien und Peroxisomen und wird durch mehrere Mechanismen reguliert, einschließlich der Aufnahme und Aktivierung von Fettsäuren, der Enzymexpression und der Verfügbarkeit von Cofaktoren wie Coenzym A und NAD +. In Assays, die die Fettsäure-β-Oxidation in Leberhomogenaten messen, maskieren die Zelllyse und die übliche Zugabe supraphysiologischer Cofaktorenspiegel die Auswirkungen dieser Regulationsmechanismen. Darüber hinaus ist die Integrität der Organellen in den Homogenaten schwer zu kontrollieren und kann zwischen den Präparaten erheblich variieren. Die Messung der Fettsäure- β-Oxidation in intakten primären Hepatozyten überwindet die oben genannten Fallstricke. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter primärer Maushepatozyten, die mit 14C-markierter Palmitinsäure inkubiert wurden. Durch die Vermeidung von Stunden bis Tagen der Kultur hat diese Methode den Vorteil, dass die Proteinexpressionsniveaus und die Stoffwechselwegaktivität der ursprünglichen Leber besser erhalten bleiben, einschließlich der Aktivierung der Fettsäure-β-Oxidation, die in Hepatozyten beobachtet wird, die von nüchternen Mäusen isoliert wurden, verglichen mit gefütterten Mäusen.

Introduction

Fettsäure-β-Oxidation ist ein essentieller Prozess im Fettstoffwechsel und bietet einen katabolen Weg, um die Fettsäuresynthese und -aufnahme aus der Nahrung auszugleichen. Dieser Prozess erzeugt Energie für mehrere Organe, einschließlich des Herzmuskels, der Nierenrinde und der nüchternen Leber, und verwendet Fettsäuren, die aus der Nahrung, der Fettgewebelipolyse und den internen Triglyceridspeicherngewonnen werden 1,2.

Die Oxidation von Fettsäuren durch den β-Oxidationsweg führt zur sequentiellen Verkürzung der Fettacylkette um zwei Kohlenstoffe gleichzeitig, die als Acetyl-CoA freigesetzt werden, und dieser Prozess findet sowohl in den Mitochondrien als auch in den Peroxisomen statt. Während die meisten Fettsäuren nur einer β-Oxidation unterzogen werden, werden einige an verschiedenen Kohlenstoffen oxidiert, bevor sie in diesen Weg eintreten. Zum Beispiel werden 3-methylsubstituierte Fettsäuren, wie Phytansäure, durch α-Oxidation in den Peroxisomen entfernt, bevor sie in den β-Oxidationsweg eintreten. Ebenso werden einige Fettsäuren zunächst durch Oxidation der terminalen Methylgruppe (ω-Oxidation) im endoplasmatischen Retikulum in Dicarbonsäuren umgewandelt, bevor sie in den Peroxisomen durch β-Oxidation bevorzugt oxidiertwerden 3.

Unabhängig von der spezifischen Organelle muss eine Fettsäure zunächst in einen Coenzym A (CoA)-Thioester oder Acyl-CoA umgewandelt werden, um über den β-Oxidationsweg oxidiert zu werden. β-Oxidation von langkettigen Acyl-CoAs in der mitochondrialen Matrix benötigt das Carnitin-Shuttle für ihre Translokation, wobei Carnitin-Palmitoyltransferase 1 (CPT1) die Umwandlung von Acyl-CoAs in Acylcarnitine katalysiert und das geschwindigkeitsbegrenzende Enzym in diesem Prozessist 4. Nach der Translokation in die mitochondriale Matrix werden die Acyl-CoAs neu geformt und dienen als Substrate für die mitochondriale β-Oxidationsmaschinerie. Im nüchternen Zustand wird das durch β-Oxidation in den hepatischen Mitochondrien erzeugte Acetyl-CoA hauptsächlich zur Ketogenese geleitet. Peroxisomen dienen als primärer Ort für die β-Oxidation von sehr langkettigen, verzweigtkettigen und dicarbonsäurehaltigen Fettsäuren. Peroxisomen benötigen das Carnitin-Shuttle nicht, um Fettsäuresubstrate zu importieren, sondern importieren die entsprechenden Acyl-CoAs durch die Aktivität der ATP-bindenden Kassettentransporter (ABC) ABCD1-35. Innerhalb der Peroxisomen werden Acyl-CoAs dann durch einen speziellen Satz von Enzymen oxidiert, die sich von der mitochondrialen Fettsäure- β-Oxidationsmaschine unterscheiden. Sowohl Mitochondrien als auch Peroxisomen benötigen auch eine Zufuhr von NAD+ und freiem CoA, um Fettacylketten zu oxidieren. Es wurde gezeigt, dass der CoA-Spiegel in der Leber als Reaktion auf das Fasten ansteigt, was die erhöhte Rate der Fettsäureoxidation unterstützt, die in diesem Zustand auftritt6. Darüber hinaus führt ein erhöhter CoA-Abbau in den Peroxisosomen zu einer selektiven Abnahme der peroxisomalen Fettsäureoxidation7. Daher wird der Prozess der Fettsäureoxidation innerhalb der Zelle durch die Expressionsniveaus und Aktivitäten von Enzymen reguliert, die an der Aktivierung, dem Transport und der Oxidation von Fettsäuren beteiligt sind, sowie durch die Konzentrationen von Cofaktoren und anderen Metaboliten in mehreren subzellulären Kompartimenten.

Verfahren, bei denen Gewebehomogenate zur Messung der Fettsäureoxidation verwendet werden, zerstören die zelluläre Architektur, die diesen Prozess reguliert und unterstützt, was zu einer Sammlung von Daten führt, die den In-vivo-Stoffwechsel nicht genau widerspiegeln. Während Techniken, die plattierte primäre Hepatozyten verwenden, dieses System erhalten, führt die Kultivierung isolierter Zellen über längere Zeiträume zu einem Verlust des In-vivo-Genexpressionsprofils, das in den Zellen vorhanden war, als sie noch im Tier lebten 8,9. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung primärer Hepatozyten und zur Bestimmung ihrer Fettsäure- β-Oxidationskapazität unmittelbar nach der Isolierung und in Suspension unter Verwendung von [1-14C]Palmitinsäure. Der Assay basiert auf der Messung der Radioaktivität, die mit den säurelöslichen Metaboliten (ASM) oder Produkten wie Acetyl-CoA assoziiert ist, die durch die β-Oxidationvon [1-14 C]palmitinsäure10,11 erzeugt werden.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren an Mäusen (C57BL/6J, Männer, 9-11 Wochen alt) wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) der West Virginia University genehmigt. 1. Hepatozyten-Isolierung Präparat Bereiten Sie in den Tagen vor der Hepatozytenisolierung die in Tabelle 1 aufgeführten Puffer und Zellkulturmedien vor. Stellen Sie ein Wasserbad mit einer Temperatur von 37 ° C in der Nähe des Ortes auf, an dem die Operation durchgeführ…

Representative Results

Die hier beschriebene Leberperfusion ergibt typischerweise 30-40 Millionen Zellen / Leber mit einer durchschnittlichen Lebensfähigkeit von 80%, wie durch den Trypanblau-Ausschluss geschätzt (Abbildung 2). Die typische Konzentration von Glucose im Krebs-Henseleit-Puffer (KHB), der zur Herstellung der Perfusionspuffer 1 und 2 verwendet wird, beträgt 11 mM. Bei der Messung der Fettsäure-β-Oxidation in Hepatozyten, die von gefasteten Mäusen isoliert wurden, kann die Glukosekonzentration im…

Discussion

Während der Leberdurchblutung ist es wichtig, die Einführung von Luftblasen zu vermeiden, da sie die Mikrokapillaren in der Leber blockieren, die Pufferzirkulation verhindern oder einschränken und insgesamt die Hepatozytenausbeute und Lebensfähigkeit verringern20,21. Vorsichtsmaßnahmen, wie die genaue Inspektion der mit Puffern gefüllten Einlassleitung vor der Kanülierung des IVC und das Vermeiden des Abhebens der Einlassleitung von dem Rohr, das Puffer 1 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss der National Institutes of Health R35GM119528 an Roberta Leonardi unterstützt.

Materials

(R)-(+)-Etomoxir sodium salt Tocris Bioscience 4539/10
[1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL American Radiolabeled Chemicals ARC 0172A
1 M HEPES, sterile Corning 25060CI
10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette Mettler Toledo 17008604
1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips
5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes
50 mL sterile centrifuge tubes CellTreat 229421
70% Perchloric acid Fisher Scientific A2296-1LB
BSA, fatty acid-free Fisher Scientific BP9704100
CaCl2 dihydrate MilliporeSigma 223506
D-(+)-Glucose MilliporeSigma G7021
EGTA Gold Biotechnology E-217
Ethanol Pharmco 111000200CSPP
Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile CellTreat 229707
Gentamicin sulphate Gold Biotechnology G-400-25
HDPE, 6.5 mL scintillation vials Fisher Scientific 03-342-3
Hemocytometer
Hypodermic needles 22 G, 1.5 in BD Biosciences 305156
Isoflurane VetOne 502017
KCl Fisher Scientific BP366-1
KH2PO4 MilliporeSigma P5655
Liberase TM Research Grade MilliporeSigma 5401119001 Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin
M199 medium MilliporeSigma M5017
MgSO4 heptahydrate MilliporeSigma M1880
Microcentrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17
Microdissecting Scissors Roboz Surgical Instrument Co RS-5980
NaCl Chem-Impex International 30070
NaHCO3 Acros Organics 424270010
Palmitic acid MilliporeSigma P0500
Penicillin/streptomycin (100x) Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Cytiva Life Sciences SH30256.01
Positive displacement pipette MR-10, 10 µL Mettler Toledo 17008575
Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes Eppendorf 5810 R
Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes Fisher Scientific 14-956-9A
Scintillation counter Perkin Elmer TriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD cocktail Fisher Scientific SX18-4
Shaking water bath, 30 L capacity New Brunswick Scientific  Model G76
Sterile cell strainers, 100 µm Fisher Scientific 22363549
Thumb Dressing Forceps Roboz Surgical Instrument Co RS-8120
Trypan Blue Corning 25900CI
Variable-flow peristaltic pump Fisher Scientific 138762
Water baths, 2–2.5 L capacity

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Vickers, S. D., Saporito, D. C., Leonardi, R. Measurement of Fatty Acid β-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes. J. Vis. Exp. (175), e62904, doi:10.3791/62904 (2021).

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