Summary

Mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes de souris fraîchement isolés

Published: September 09, 2021
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Summary

La β-oxydation des acides gras est une voie métabolique essentielle responsable de la génération d’énergie dans de nombreux types de cellules, y compris les hépatocytes. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer l’oxydation β des acides gras dans des hépatocytes primaires fraîchement isolés en utilisant de l’acide palmitique marqué 14C.

Abstract

La β-oxydation des acides gras est une voie métabolique clé pour répondre aux besoins énergétiques du foie et fournir des substrats et des cofacteurs pour des processus supplémentaires, tels que la cétogenèse et la gluconéogenèse, qui sont essentiels pour maintenir l’homéostasie du glucose dans tout le corps et soutenir la fonction extra-hépatique des organes à jeun. La β-oxydation des acides gras se produit dans les mitochondries et les peroxysomes et est régulée par de multiples mécanismes, y compris l’absorption et l’activation des acides gras, les niveaux d’expression enzymatique et la disponibilité de cofacteurs tels que la coenzyme A et le NAD +. Dans les essais qui mesurent la β-oxydation des acides gras dans les homogénats hépatiques, la lyse cellulaire et l’ajout commun de niveaux supraphysiologiques de cofacteurs masquent les effets de ces mécanismes de régulation. De plus, l’intégrité des organites dans les homogénats est difficile à contrôler et peut varier considérablement d’une préparation à l’autre. La mesure de la β-oxydation des acides gras dans des hépatocytes primaires intacts surmonte les pièges ci-dessus. Ce protocole décrit une méthode de mesure de la β-oxydation des acides gras dans une suspension d’hépatocytes primaires de souris fraîchement isolés incubés avec de l’acide palmitique marqué 14C. En évitant les heures à les jours de culture, cette méthode a l’avantage de mieux préserver les niveaux d’expression des protéines et l’activité de la voie métabolique du foie d’origine, y compris l’activation de l’β-oxydation des acides gras observée dans les hépatocytes isolés de souris à jeun par rapport aux souris nourries.

Introduction

La β-oxydation des acides gras est un processus essentiel dans le métabolisme des lipides, fournissant une voie catabolique pour équilibrer la synthèse des acides gras et l’apport de l’alimentation. Ce processus génère de l’énergie pour plusieurs organes, y compris le muscle cardiaque, le cortex rénal et le foie à jeun, et utilise les acides gras obtenus à partir de l’alimentation, la lipolyse du tissu adipeux et les réserves internes de triglycérides 1,2.

L’oxydation des acides gras par la voie β-oxydation entraîne le raccourcissement séquentiel de la chaîne acylique grasse par deux carbones à la fois, libérés sous forme d’acétyl-CoA, et ce processus se produit à la fois dans les mitochondries et les peroxysomes. Alors que la plupart des acides gras ne subissent qu’une β-oxydation, certains sont oxydés à différents carbones avant d’entrer dans cette voie. Par exemple, les acides gras substitués au 3-méthyle, tels que l’acide phytanique, subissent l’élimination d’un carbone par α-oxydation dans les peroxysomes avant d’entrer dans la voie de β-oxydation. De même, certains acides gras sont d’abord convertis en acides gras dicarboxyliques par oxydation du groupe méthyle terminal (ω-oxydation) dans le réticulum endoplasmique avant d’être préférentiellement oxydés dans les peroxysomes par β-oxydation3.

Quel que soit l’organite spécifique, un acide gras doit d’abord être converti en un thioester de coenzyme A (CoA), ou acyl-CoA, pour être oxydé par la voie de β-oxydation. β-oxydation des acyl-CoA à longue chaîne dans la matrice mitochondriale nécessite la navette carnitine pour leur translocation, où la carnitine palmitoyltransférase 1 (CPT1) catalyse la conversion des acyl-CoAs en acylcarnitines et est l’enzyme limitant le taux dans ce processus4. Une fois transloqués dans la matrice mitochondriale, les acyl-CoAs sont reformés et servent de substrats à la machinerie mitochondriale β-oxydation. À jeun, l’acétyl-CoA produit par β-oxydation dans les mitochondries hépatiques est principalement canalisé vers la cétogenèse. Les peroxysomes servent de site principal pour la β-oxydation des acides gras à très longue chaîne, à chaîne ramifiée et dicarboxyliques. Les peroxysomes n’ont pas besoin de la navette carnitine pour importer des substrats d’acides gras, mais importent plutôt les acyl-CoA correspondants par l’activité des transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC) ABCD1-35. Dans les peroxysomes, les acyl-CoAs sont ensuite oxydés par un ensemble dédié d’enzymes, distinctes de la machinerie mitochondriale d’β-oxydation des acides gras. Les mitochondries et les peroxysomes nécessitent également un apport de NAD+ et de CoA libre pour oxyder les chaînes acyles grasses. Il a été démontré que les niveaux de CoA dans le foie augmentent en réponse au jeûne, ce qui favorise l’augmentation du taux d’oxydation des acides gras qui se produit dans cet état6. De plus, l’augmentation de la dégradation du CoA dans les peroxysomes entraîne une diminution sélective de l’oxydation des acides gras peroxysomaux7. Par conséquent, le processus d’oxydation des acides gras dans la cellule est régulé par les niveaux d’expression et les activités des enzymes impliquées dans l’activation, le transport et l’oxydation des acides gras, ainsi que par les concentrations de cofacteurs et d’autres métabolites dans plusieurs compartiments subcellulaires.

Les procédures utilisant des homogénats tissulaires pour mesurer l’oxydation des acides gras détruisent l’architecture cellulaire régulant et soutenant ce processus, conduisant à une collecte de données qui ne reflètent pas avec précision le métabolisme in vivo. Alors que les techniques utilisant des hépatocytes primaires plaqués préservent ce système, la culture de cellules isolées pendant de longues périodes entraîne une perte du profil d’expression génique in vivo qui était présent dans les cellules lorsqu’elles vivaient encore chez l’animal 8,9. Le protocole suivant décrit une méthode pour isoler les hépatocytes primaires et tester leur capacité à β-oxydation des acides gras immédiatement après l’isolement et en suspension, en utilisant l’acide [1-14C]palmitique. Le dosage est basé sur la mesure de la radioactivité associée aux métabolites solubles dans l’acide (ASM) ou à des produits, comme l’acétyl-CoA, produits par la β-oxydation de l’acide [1-14C]palmitique10,11.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales sur des souris (C57BL/6J, mâles, âgés de 9 à 11 semaines) ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Virginie-Occidentale. 1. Isolement des hépatocytes Préparation Dans les jours précédant l’isolement des hépatocytes, préparer les tampons et les milieux de culture cellulaire énumérés dans le tableau 1. Installez un bain-marie…

Representative Results

La perfusion hépatique décrite ici donne généralement 30 à 40 millions de cellules/foie avec une viabilité moyenne de 80 %, telle qu’estimée par l’exclusion du bleu de trypan (Figure 2). La concentration typique de glucose dans le tampon Krebs-Henseleit (KHB), qui est utilisé pour préparer les tampons de perfusion 1 et 2, est de 11 mM. Lors de la mesure de la β-oxydation des acides gras dans des hépatocytes isolés de souris à jeun, la concentration de glucose dans le KHB peu…

Discussion

Pendant la perfusion hépatique, il est essentiel d’éviter l’introduction de bulles d’air, car elles bloquent les microcapillaires dans le foie, empêchant ou restreignant la circulation tampon et diminuant globalement le rendement en hépatocytes et la viabilité20,21. Des précautions, telles qu’une inspection minutieuse de la conduite d’entrée remplie de tampon avant la canulation de la CIV et éviter de soulever la conduite d’entrée du tube con…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la subvention R35GM119528 des National Institutes of Health à Roberta Leonardi.

Materials

(R)-(+)-Etomoxir sodium salt Tocris Bioscience 4539/10
[1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL American Radiolabeled Chemicals ARC 0172A
1 M HEPES, sterile Corning 25060CI
10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette Mettler Toledo 17008604
1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips
5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes
50 mL sterile centrifuge tubes CellTreat 229421
70% Perchloric acid Fisher Scientific A2296-1LB
BSA, fatty acid-free Fisher Scientific BP9704100
CaCl2 dihydrate MilliporeSigma 223506
D-(+)-Glucose MilliporeSigma G7021
EGTA Gold Biotechnology E-217
Ethanol Pharmco 111000200CSPP
Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile CellTreat 229707
Gentamicin sulphate Gold Biotechnology G-400-25
HDPE, 6.5 mL scintillation vials Fisher Scientific 03-342-3
Hemocytometer
Hypodermic needles 22 G, 1.5 in BD Biosciences 305156
Isoflurane VetOne 502017
KCl Fisher Scientific BP366-1
KH2PO4 MilliporeSigma P5655
Liberase TM Research Grade MilliporeSigma 5401119001 Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin
M199 medium MilliporeSigma M5017
MgSO4 heptahydrate MilliporeSigma M1880
Microcentrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17
Microdissecting Scissors Roboz Surgical Instrument Co RS-5980
NaCl Chem-Impex International 30070
NaHCO3 Acros Organics 424270010
Palmitic acid MilliporeSigma P0500
Penicillin/streptomycin (100x) Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Cytiva Life Sciences SH30256.01
Positive displacement pipette MR-10, 10 µL Mettler Toledo 17008575
Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes Eppendorf 5810 R
Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes Fisher Scientific 14-956-9A
Scintillation counter Perkin Elmer TriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD cocktail Fisher Scientific SX18-4
Shaking water bath, 30 L capacity New Brunswick Scientific  Model G76
Sterile cell strainers, 100 µm Fisher Scientific 22363549
Thumb Dressing Forceps Roboz Surgical Instrument Co RS-8120
Trypan Blue Corning 25900CI
Variable-flow peristaltic pump Fisher Scientific 138762
Water baths, 2–2.5 L capacity

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Vickers, S. D., Saporito, D. C., Leonardi, R. Measurement of Fatty Acid β-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes. J. Vis. Exp. (175), e62904, doi:10.3791/62904 (2021).

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