Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi
Summary
Bu yöntem, toplam RNA ekstresinden miRNA’ları tespit etmek için kuzey hibridizasyon tekniğinin kullanımını göstermektedir.
Abstract
MicroRNA’lar (miRNA’lar) hem bitkilerde hem de hayvanlarda gen ekspresyonunun düzenlenmesinde rol oynayan endojen olarak ifade edilen kodlamayan, ~21 nt küçük RNA’lar sınıfıdır. MiRNA’ların çoğu, anahtar genleri hedefleyen gen ekspresyonunun negatif anahtarları olarak hareket eder. Bitkilerde, birincil miRNA ‘lar (pri-miRNA’lar) transkriptleri RNA polimeraz II tarafından oluşturulur ve pre-miRNA adı verilen kararlı kök-döngü yapılarının değişen uzunluklarını oluştururlar. Bir ensonükleaz, Dicer benzeri1, miRNA-miRNA* dublekslerine pre-miRNA’ları işler. MiRNA-miRNA* dubleks iplikçiklerinden biri seçilir ve hedef mRNA’ların bölünmesine aracılık etmek için Argonaute 1 proteinine veya homologlarına yüklenir. MiRNA’lar anahtar sinyal molekülleri olmasına rağmen, bunların tespiti genellikle hassas bir kuzey leke analizi yerine optimal PCR tabanlı yöntemlerden daha az yöntemle gerçekleştirilir. Biz çok yüksek hassasiyet ile miRNA düzeylerinin sayısallaştırılması için ideal basit, güvenilir ve son derece hassas kuzey yöntemi tarif, kelimenin tam anlamıyla herhangi bir bitki dokusundan. Ayrıca, bu yöntem boyutu, kararlılık ve miRNA ve öncüllerinin bolluğunu onaylamak için kullanılabilir.
Introduction
Küçük düzenleyici RNA’lar, mikroRNA’lar, son keşif onları ve bitki vehayvanlardakirollerini anlamak araştırma yol açmıştır 1 . MiRNA’ların uzun öncüleri HYL1 ve spesifik dicer benzeri proteinler2,3ile 21-24 nt olgun miRNA’lara işlenir. Bir 22 nt miRNA ikincil siRNA’lar4oluşturarak basamaklı susturma başlatabilirsiniz. Çalışmalar gelişme miRNA’lar ve ikincil siRNA’ların rolünü göstermiştir, hücre kaderi ve stres yanıtları5,6.
Kuzey hibridizasyonu belirli RNA moleküllerini tespit etmek için rutin olarak kullanılan deneysel bir yöntemdir. Bu yöntem, toplam RNA7bir havuzdan yaklaşık 19 -24 nt uzun küçük RNA tespitinde kullanımını özelleştirmektedir. Bu gösteride, miRNA’ların saptanması ve ölçülmesi için bu tekniğin kullanımını gösteriyoruz. Bu yöntem, radyoizotoplar kullanarak probların etiketlenmesi kullanır; böylece numunedeki miRNA düzeyleri artan hassasiyetle saptayabilir. PCR tabanlı yöntemlerden farklı olarak, bu yöntem ifadenin nicelemesini ve miRNA’ların boyut tayinini sağlar. Bu protokolde miRNA tespitini geliştiren önemli adımlar gösteriyoruz. MiRNA’ların yüksek çözünürlüklü sinyal algılaması için lekeleme ve hibridizasyon adımlarını değiştirdik. Bu teknik aynı zamanda siRNA, tasi-sekonder RNA ve snoRNA gibi diğer endojen küçük RNA’ların saptanması için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem, daha az bol miRNA’lar da dahil olmak üzere küçük RNA’ların saptanması ve ölçülmesi için yaygın olarak kullanılabilir. Protokol esas olarak bir yükleme tamponunda toplam RNA’nın denatife, jel elektroforezinin boyut ayrımına, RNA’nın bir membrana aktarılmasına, RNA’nın membrana çapraz bağlanmasına ve istenilen radyoetiketli oligo probları kullanılarak hibridize edilmesine yönelik adımları açıklar.
Herhangi bir lekeleme deneyi için kritik adım, numune h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar radyoizotop için ev sahibi enstitü ve BRIT tarafından sağlanan radyasyon laboratuvarına erişim kabul. PVS laboratuvarı Ulusal Biyolojik Bilimler Merkezi, Tata Temel Araştırma Enstitüsü ve hibeler tarafından desteklenir (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/İsviçre/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü’nden. MP DBT-Araştırma Associateship, DBT, Hindistan Hükümeti kabul eder.
Materials
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
