식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석
Summary
이 방법은 전체 RNA 추출물로부터 miRNAs를 검출하기 위해 북부 혼성화 기술의 사용을 보여줍니다.
Abstract
MicroRNAs(miRNAs)는 내인성 발현비의 클래스로, ~21nt 소형 RNA는 식물과 동물 모두에서 유전자 발현의 조절에 관여한다. 대부분의 miRNAs는 주요 유전자를 표적으로 하는 유전자 발현의 음성 스위치로 작동합니다. 식물에서, 1 차 miRNAs (pri-miRNAs) 전사체는 RNA 폴리머라제 II에 의해 생성되고, 그(것)들은 pre miRNAs에게 불린 안정한 줄기 루프 구조물의 다양한 길이를 형성합니다. 엔도누클레스, 디커 와 같은1, miRNA-miRNA * 이중으로 사전 miRNA를 처리합니다. miRNA-miRNA* 듀플렉스에서 가닥 중 하나가 선택되고 Argonaute 1 단백질 또는 그 동형로그에 적재되어 표적 mRNA의 분열을 중재합니다. miRNAs는 주요 신호 분자이지만, 그들의 검출은 수시로 민감한 북부 얼룩 분석 대신 최적 PCR 기지를 둔 방법에 의해 실행됩니다. 우리는 모든 식물 조직에서 매우 높은 감도로 miRNA 수준의 정량화에 이상적인 간단하고 신뢰할 수 있으며 매우 민감한 북부 방법을 설명합니다. 또한 이 방법을 사용하여 miRNAs 및 전구체의 크기, 안정성 및 풍부를 확인할 수 있습니다.
Introduction
작은 규제 RNA의 최근 발견, microRNA, 그(것)들을 이해하는 연구 및 식물과 동물에 있는 그들의 역할1을지도했습니다. miRNAs의 긴 전구체는 HYL1 및 특정 dicer 같이 단백질2,,3에의해 21 에서 24 nt 성숙한 miRNAs로 가공됩니다. 22 nt miRNA는 이차 siRNAs4를생성하여 캐스케이드 침묵을 시작할 수 있습니다. 연구 결과는 발달, 세포 운명 및 응력반응에서miRNAs 및 이차 siRNAs의 역할을 보여주었습니다5,6.
북부 혼성화는 특정 RNA 분자를 검출하기 위해 일상적으로 사용되는 실험 방법입니다. 이 방법은 총 RNA 7의 풀에서 약 19-24 nt 긴 작은 RNA의 검출에 그것의 사용을 사용자 정의한다. 이 데모에서는 miRNA의 검출 및 정량화를 위해 이 기술의 사용을 설명합니다. 이 방법은 방사성 동위원소를 사용하여 프로브의 라벨링을 사용합니다. 따라서, 샘플내의 miRNA 수준은 감도증가로 검출될 수 있다. PCR 기반 방법과 달리 이 메서드는 miRNAs의 크기 결정뿐만 아니라 식의 정량화를 보장합니다. 이 프로토콜에서는 miRNA 탐지를 개선하는 중요한 단계를 보여줍니다. 우리는 miRNA의 고해상도 신호 검출을 얻기 위한 블로팅 및 혼성화단계를 수정했습니다. 이 기술은 또한 siRNAs, 타시 보조 RNA 및 snoRNAs와 같은 그밖 내인성 작은 RNA를 검출하기 위해 사용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법은 덜 풍부한 miRNA를 포함하여 작은 RNA의 검출 및 정량화에 광범위하게 사용될 수 있습니다. 프로토콜은 주로 로딩 버퍼에서 총 RNA를 분해하는 단계를 설명하고, 겔 전기포에 의한 크기 분리, 멤브레인으로 RNA의 전달, RNA를 멤브레인에 교차 연결하고 원하는 방사성 표지된 올리고 프로브를 사용하여 혼성화한다.
모든 블로팅 실험에 대한 중요한 단계는 샘플 준비를위한…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 방사선 동위 원소를 위한 호스트 연구소 및 BRIT에 의해 제공된 방사선 실험실에 접근을 인정합니다. PVS 실험실은 국립 생물 과학 센터, 기본 연구 및 보조금타타 연구소 (BT / PR12394 / AGIII / 103/891/2014; BT/IN/스위스/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) 인도 정부 생명공학부. MP는 DBT 연구 준회원, DBT, 인도 정부를 인정한다.
Materials
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
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- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
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