تحليل RNA لطخة للكشف عن و الكم من MicroRNAs النبات
Summary
يوضح هذا الأسلوب استخدام تقنية التهجين الشمالي للكشف عن الميرناس من إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) هي فئة من غير ترميز أعرب عن الذات، ~ 21 NT RNAs صغيرة تشارك في تنظيم التعبير الجيني في كل من النباتات والحيوانات. معظم miRNAs بمثابة مفاتيح سلبية للتعبير الجيني التي تستهدف الجينات الرئيسية. في النباتات، يتم إنشاء النصوص miRNAs الأولية (pri-miRNAs) بواسطة بوليميراز RNA الثاني، وأنها تشكل أطوال متفاوتة من هياكل حلقة الجذعية مستقرة تسمى ما قبل ميرناس. و endonuclease، Dicer-مثل1، يعالج ما قبل ميرناس في ميرنا ميرنا * دوبليكس. يتم اختيار أحد الخيوط من ميرنا ميرنا * دوبليكس وتحميلها على بروتين Argonaute 1 أو homologs للتوسط في شق mRNAs الهدف. على الرغم من أن الجزيئات الرئيسية التي تشير إلى الإشارات miRNAs، غالبا ما يتم الكشف عنها من قبل أقل من الطرق المثلى القائمة PCR بدلا من تحليل البقعة الشمالية الحساسة. نحن وصف طريقة بسيطة وموثوقة، وحساسة للغاية الشمالية التي هي مثالية للكمية من مستويات ميرنا مع حساسية عالية جدا، حرفيا من أي نسيج نباتي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتأكيد حجم واستقرار ووفرة الـ miRNAs وسلائفها.
Introduction
الاكتشاف الأخير للرنا RNAs التنظيمية الصغيرة، microRNAs، قاد البحوث في فهمها ودورها في النباتات والحيوانات1. تتم معالجة السلائف الطويلة من miRNAs إلى 21 إلى 24 nt ناضجة miRNAs بواسطة HYL1 والبروتينات المحددة مثل dicer2,3. A 22 NT ميرنا يمكن أن تبدأ تتالي إسكات عن طريق توليد siRNAs الثانوية4. وقد أظهرت الدراسات دور ميرناس و siRNAs الثانوية في التنمية, الخلية مصير واستجابات الإجهاد5,6.
التهجين الشمالي هو طريقة تجريبية تستخدم بشكل روتيني للكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي محددة. هذا الأسلوب يخصص استخدامه في الكشف عن حوالي 19 -24 NT RNAs صغيرة طويلة من مجموعة من مجموع RNAs7. في هذه التظاهرة، ونحن توضيح استخدام هذه التقنية للكشف عن وكمية من miRNAs. وتستخدم هذه الطريقة وسم المجس باستخدام النظائر المشعة؛ وبالتالي، يمكن الكشف عن مستويات ميرنا في العينة مع زيادة الحساسية. على عكس الطرق القائمة على PCR، يضمن هذا الأسلوب تحديد كم التعبير وكذلك تحديد حجم miRNAs. في هذا البروتوكول، نعرض خطوات حاسمة لتحسين الكشف عن ميرنا. لقد قمنا بتعديل الخطوات في النشاف والتهجين للحصول على الكشف إشارة عالية الدقة من miRNAs. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية للكشف عن RNAs صغيرة أخرى الذاتية مثل RNAs، رنا فاسي الثانوية وsnoRNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمكن استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع للكشف عن الرنا الصغير وتحديد كمهاته بما في ذلك الرنا الرنا الأقل وفرة. البروتوكول يصف أساسا الخطوات ل denaturing مجموع الجيش الملكي النيبالي في مخزن التحميل العازلة ، وحجم الفصل بواسطة جل electrophoresis ، ونقل الجيش الملكي النيبالي إلى غشاء ، عبر ربط الجيش الم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعترف المؤلفون بإمكانية الوصول إلى مختبر الإشعاع الذي يوفره المعهد المضيف والمعهد البريطاني للنظائر المشعة. ويدعم مختبر PVS المركز الوطني للعلوم البيولوجية، معهد تاتا للبحوث الأساسية والمنح (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014؛ BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19؛ BT/PR25767/GET/119/151/2017) من وزارة التكنولوجيا الحيوية، حكومة الهند. النائب يعترف DBT البحوث المنتسبين، DBT، حكومة الهند.
Materials
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
