ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח
Summary
שיטה זו ממחישה את השימוש בטכניקת הכלאה הצפוני כדי לזהות miRNAs מתוך תמצית RNA מוחלטת.
Abstract
מיקרורונאס (miRNAs) הם מחלקה של מבוטא באופן שגוי בקידוד, ~ 21 nt RNAs קטן מעורב בוויסות של ביטוי גנים בשני הצמחים ובעלי חיים. רוב miRNAs לפעול כמתגים שליליים של ביטוי גנים מיקוד גנים מפתח. ב צמחים, ראשי miRNAs (פרי-miRNAs) התעתיקים נוצרות על ידי RNA פולימראז II, והם יוצרים אורכים שונים של מבנים גזע לולאה יציבה בשם pre-miRNAs. הסכם endonuclease, Dicer-like1, מעבד את מקדם-מירנס לתוך דופלקסים של Mirnas-Mirnas. אחד הגדילים מ-miRNA-miRNA * דופלקס נבחר ונטען על החלבון 1 Argonaute או הומויומנים שלה כדי לתווך את המחשוף של mRNAs היעד. למרות miRNAs הם מולקולות איתות מפתח, הזיהוי שלהם מבוצע לעתים קרובות על-ידי פחות שיטות מבוססות PCR מיטביות במקום ניתוח כתמי בצפון רגיש. אנו מתארים פשוטה, אמין, שיטה צפונית מאוד רגיש האידיאלי עבור כימות של רמות miRNA עם רגישות גבוהה מאוד, פשוטו כמשמעו מכל רקמת הצמח. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לאשר את הגודל, היציבות והשפע של miRNAs ואת הסמנים הקדם.
Introduction
הגילוי האחרון של RNAs ברגולציה קטנה, microRNAs, הוביל מחקר בהבנת אותם ואת תפקידם בצמחים ובעלי חיים1. משתמשים ארוכי-סמנים של mirnas מעובדים לתוך 21 כדי 24 nt בוגרת mirnas על ידי HYL1 ו-dicer מסוימים כמו חלבונים2,3. A 22 nt miRNA יכול ליזום מדורגת על ידי יצירת siRNAs משני4. מחקרים הראו את התפקיד של mirnas ואת sirnas משני בפיתוח, הגורל תא התגובות הלחץ5,6.
הכלאה בצפון היא שיטה ניסיונית המועסקים באופן שגרתי כדי לזהות מולקולות RNA מסוימות. שיטה זו מתאים אישית את השימוש שלה בזיהוי של כ-19 -24 nt RNAs קטן ארוך מתוך מאגר של סך RNAs7. בהפגנה זו אנו ממחישים את השימוש בטכניקה זו לאיתור ולקוונפיקציה של miRNAs. שיטה זו משתמשת בתיוג של הגששים באמצעות רדיואיזוטופים; thus, רמות miRNA במדגם ניתן להבחין עם רגישות מוגברת. שלא כמו שיטות המבוססות על PCR, שיטה זו מבטיחה כימות ביטוי, כמו גם קביעת גודל של ה-miRNAs. בפרוטוקול זה, אנו מציגים צעדים מכריעים המשפרים את גילוי miRNA. שינו שינוי בשלבים בגושים והיברידיזציה לקבלת זיהוי אותות ברזולוציה גבוהה של miRNAs. טכניקה זו יכולה לשמש גם לאיתור RNAs קטנים שונים אנדוגניים כגון siRNAs, tasi-RNAs משנית ו שנחונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתן להשתמש בשיטה זו בהרחבה לאיתור וכימות של RNAs קטנים כולל מירנאס שופע פחות. הפרוטוקול מתאר בעיקר את השלבים של העברת ה-RNA הכולל במאגר טעינה, גודל הפרדה על ידי אלקטרופורזה ג’ל, העברה של RNA לקרום, להצליב את הקישור RNA אל ממברנה וhybridize באמצעות רדיויניום בדיקה הרצוי oligo.
הצעד הקריטי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בגישה למעבדת קרינה שמספקת המכון המארח וברית לרדיואיזוטופ. PVS מעבדה נתמכת על ידי המרכז הלאומי למדעים ביולוגיים, מכון טאטא למחקר ומענקים בסיסיים (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/ב/שוויצרי/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/קבל/119/151/2017) מהמחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו. MP מכיר DBT-מחקר האסוציאטאניה, DBT, ממשלת הודו.
Materials
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
