Summary

RNA Blot Analyse voor de detectie en kwantificering van Plant MicroRNAs

Published: July 11, 2020
doi:

Summary

Deze methode toont het gebruik van de noordelijke hybridisatie techniek om miRNAs te detecteren van de totale RNA extract.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse van endogene uitgedrukte niet-codering, ~ 21 nt kleine RNAs die betrokken zijn bij de regulering van genexpressie in zowel planten als dieren. De meeste miRNAs fungeren als negatieve schakelaars van genexpressie gericht op belangrijke genen. In planten worden primaire miRNAs (pri-miRNAs) transcripties gegenereerd door RNA polymerase II, en ze vormen verschillende lengtes van stabiele stam-lusstructuren genaamd pre-miRNAs. Een endonuclease, Dicer-like1, verwerkt de pre-miRNAs tot miRNA-miRNA* duplexen. Een van de strengen van miRNA-miRNA* duplex wordt geselecteerd en geladen op Argonaute 1-eiwit of de homologs ervan om het decolleté van doelmrnas te bemiddelen. Hoewel miRNAs belangrijke signaalmoleculen zijn, wordt hun detectie vaak uitgevoerd door minder dan optimale PCR-gebaseerde methoden in plaats van een gevoelige noordelijke vlekanalyse. We beschrijven een eenvoudige, betrouwbare en uiterst gevoelige noordelijke methode die ideaal is voor de kwantificering van miRNA-niveaus met een zeer hoge gevoeligheid, letterlijk van elk plantweefsel. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de grootte, stabiliteit en de overvloed aan miRNAs en hun precursoren te bevestigen.

Introduction

De recente ontdekking van kleine regulerende RNAs, microRNAs, heeft geleid tot onderzoek in het begrijpen van hen en hun rol in planten en dieren1. Lange voorlopers van miRNAs worden verwerkt tot 21 tot 24 nt volwassen miRNAs door HYL1 en specifieke dicer-achtige eiwitten2,3. Een miRNA van 22 nt kan cascade-uitschakeling initiëren door secundaire siRNAs4te genereren. Studies hebben aangetoond dat de rol van miRNAs en secundaire siRNAs in ontwikkeling, cellot en stress reacties5,6.

Noordelijke hybridisatie is een experimentele methode die routinematig wordt gebruikt om specifieke RNA-moleculen te detecteren. Deze methode past het gebruik ervan aan bij de detectie van ongeveer 19-24 nt lange kleine RNAs uit een pool van totale RNAs7. In deze demonstratie illustreren we het gebruik van deze techniek voor de detectie en kwantificering van miRNAs. Deze methode maakt gebruik van de etikettering van sondes met behulp van radio-isotopen; zo kunnen miRNA-niveaus in het monster worden gedetecteerd met een verhoogde gevoeligheid. In tegenstelling tot pcr-gebaseerde methoden, deze methode zorgt voor kwantificering van de expressie, alsmede de grootte bepaling van de miRNAs. In dit protocol laten we cruciale stappen zien die de miRNA-detectie verbeteren. We hebben stappen in blotting en hybridisatie aangepast voor het verkrijgen van hoge resolutie signaaldetectie van miRNAs. Deze techniek kan ook worden gebruikt voor de detectie van andere endogene kleine RNAs zoals siRNAs, tasi-secundaire RNAs en snoRNAs.

Protocol

1. Voorbereiding van een 15% denaturering polyacrylamide gel Weeg en voeg 4,8 g ureum toe, voeg 3,75 mL acrylamide toe van 40% acrylamide: bisacrylamide (19:1) oplossing en 1 mL van 10x TBE pH 8.2 in een steriele 50 mL buis. Los het ureum op met een waterbad van 60 °C tot een duidelijke oplossing. Maak het volume op tot 10 mL met vers automatisch geautolaveerd steriel water en koel het gelmengsel af tot kamertemperatuur. Bereid verse 10% (w/v) ammonium persulfate oplossing. <…

Representative Results

In deze demonstratie hebben we de expressie van miR397 ontdekt en gekwantificeerd in verschillende weefsels van indica rijst var whiteponni (figuur 1). miR397 is een 22 nt miRNA en geconserveerd miRNA. De expressie van miR397 kan worden gedetecteerd in alle geteste monsters. Volgens de volgende generatie sequencing gegevens, monster 1 (zaailing weefsel) heeft miR397 op 5 leest per miljoen (rpm). We ontdekten het signaal comfortabel, wat aangeeft dat de methode zeer gevoelig…

Discussion

Deze methode kan op grote schaal worden gebruikt voor detectie en kwantificering van kleine RNAs, waaronder minder overvloedige miRNAs. Het protocol beschrijft voornamelijk de stappen voor het denatureren van het totale RNA in een laadbuffer, groottescheiding door gel elektroforese, overdracht van RNA naar een membraan, kruis-link het RNA op membraan en hybridiseren met behulp van de gewenste radiolabeled oligo sondes.

De cruciale stap voor elk blotting experiment is het gebruik van goede kwal…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen de toegang tot stralingslab die door het gastinstituut en BRIT voor radio-isotoop wordt verstrekt. PVS laboratorium wordt ondersteund door National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) van het Department of Biotechnology, Regering van India. MP erkent DBT-Research Associateship, DBT, Regering van India.

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution Sigma A9926
Ammonium persulphate (APS) BioRad 1610700
Blotting paper whatmann blotting paper I 1001-125
Bromophenol blue Sigma B5525-5G
Capillary loading tips BioRad 2239915
Deionized formamide Ambion AM9342
Heating block Eppendorff 5350
Hybond N+nylon membrane GE RPN203B
Hybridization bottle Sigma Z374792-1EA
Hybridization Oven Thermo Scientific 1211V79
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma T7024-25ml
PhosphorImager GE- Typhoon scanner 29187194
PhosphorImager screen and cassette GE healthcare GE28-9564-75
Pipettes Gilson, models: P20 and P10 FA10002M, FA10003M
Plastic pipette Falcon 357550
Polyacrylamide gel apparatus BioRad 1658003EDU
Sephadex G-25 column GE healthcare 27532501
Speed Vac Concentrator Thermo Scientific 20-548-130
Spinwin Tarsons 1010
T4 Polynucleotide Kinase (PNK) NEB M0201S
Transblot apparatus BioRad 1703946
ULTRAHyb hybridization buffer Ambion AM8670
Urea Fischer Scientific 15985
UV-crosslinker UVP CL-1000L
Vortex Tarsons 3020
Water bath NEOLAB D-8810
Xylene cyanol Sigma X4126-10G

References

  1. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
  2. Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
  3. Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
  4. Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
  5. Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
  6. Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
  7. Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
  8. Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
  9. Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
  10. Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).

Play Video

Cite This Article
Tirumalai, V., Prasad, M., Shivaprasad, P. V. RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs. J. Vis. Exp. (161), e61394, doi:10.3791/61394 (2020).

View Video