Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Se ha notificado una sola mutación en eng (CD105) en pacientes con HHT. La mutación conduce a una mayor proliferación de las CE y a una reducción del alargamiento de las CE mediada por el flujo^1,2. También se ha informado previamente que la deficiencia de ENG reduce la expresión de marcadores endoteliales (es decir, kdrl, cdh5, hey2) en el pez cebra³. La endoglina, expresada principalmente en células endoteliales, es una glicoproteína transmembrana y funciona como un co-receptor para la transformación de los miembros de la familia factor de crecimiento (TGF-). Dirige la unión BMP9 a la superficie celular para regular el gen aguas abajo, incluida la expresión Id1, para inducir la diferenciación de células madre hacia las CE^4. Por lo tanto, el gen eng desempeña un papel importante en la vasculogénesis y la enfermedad vascular humana^5,6. Hemos examinado previamente los efectos del derribo de endogina en la formación de buques en embriones de pez cebra, seguido de un análisis de las CE derivadas de iPSC adquiridas a un paciente con HHT que lleva una mutación⁷. Este protocolo demuestra los efectos de la deficiencia de ENG en la expresión del marcador de progenitor endotelial y la formación de tubos, que es un método cuantificable para medir la angiogénesis in vitro.

Para estudiar la expresión espacial y temporal, WISH se emplea para detectar la expresión génica in vivo⁸. La hibridación in situ (ISH) es un método de uso de sondas etiquetadas con secuencias de complemento de ácidos nucleicos diana (ADN o ARNm) para detectar y visualizar híbridos de ácido nucleico objetivo en una muestra fija. El proceso amplifica las señales de expresión génica in vivo y se utiliza para detectar la expresión de genes mediante microscopía. WISH ha sido ampliamente utilizado en varios animales modelo, especialmente en peces cebra⁹. También se utiliza para adquirir los siguientes datos: 1) patrones de expresión espacial/temporal del gen, que proporcionan información sobre la función y clasificación del gen; y 2) marcadores genéticos expresados específicamente que se utilizan en fármacos de alto rendimiento o cribado mutante¹⁰.

Las sondas cromogénicas se degradan fácilmente con la hibridación in situ del cromosoma tradicional (CISH), lo que da como resultado un alto ruido de fondo y señales inespecíficas^11,12. El método WISH utiliza dos sondas Z dobles independientes, que están diseñadas para hibridizar a las secuencias de ARN de destino. Cada sonda contiene una secuencia de 18-25 complementaria al ARN objetivo y una secuencia de cola de 14 bases (conceptualizada como Z). Los sondeos de destino se utilizan en un par (doble Z). Las dos secuencias de cola juntas forman un sitio de hibridación de 28 bases para el preamplificador, que contiene 20 sitios de unión para el amplificador. El amplificador, a su vez, contiene 20 sitios de unión para la sonda de etiquetas y teóricamente puede producir hasta 8.000 etiquetas para cada secuencia de ARN de destino.

Esta avanzada tecnología facilita la amplificación simultánea de la señal y la supresión de fondo para lograr la visualización de una sola molécula, preservando al mismo tiempo la morfología tisular¹³. La modificación adicional de los métodos WISH se basa en investigaciones anteriores^14,incluyendo fijación adicional y tinción DAB. Aquí se proporciona un protocolo WISH mejorado que puede funcionar incluso si el ARN objetivo se reduce o degrada parcialmente. Las ventajas incluyen que se puede completar en 24 h sin condiciones libres de RNase. Las señales también se pueden detectar simultáneamente a través de múltiples canales desde múltiples destinos, y los resultados son consistentes y compatibles con los resultados de diferentes plataformas de automatización de alto rendimiento.

Los resultados de modelos animales no son necesarios reflejan el mismo fenómeno que ocurre en los seres humanos. ENG contiene dos pares de ciisteínas conservadas, C30-C207 y C53-C182, que forman puentes de disulfuro en regiones huérfanas. Para seguir estudiando el papel del eng en pacientes con HHT, se han llevado a cabo ensayos de formación de tubos con iPSC derivados de pacientes con HHT en células sin/con mutaciones eng (Cys30Arg, C30R)¹⁵. Después de que Kubota et al. informaron por primera vez el experimento de formación de^{tubos 16,}el ensayo se ha desarrollado de varias maneras. Se ha utilizado para identificar factores angiogénicos o antiangiogénicos, definir las vías de señalización en la angiogénesis e identificar genes que regulan la angiogénesis¹⁷.

Antes de la disponibilidad de iPSC-CE derivados del paciente, los investigadores utilizaron principalmente ECs cultivados para estudiar la angiogensis¹⁶. Sin embargo, para las células endoteliales, es un desafío técnico transducir genes exógenos con un virus, debido al número limitado de pasaje al que pueden sufrir las ECs. Esto se debe a que no hay suficiente material celular para ser recogido de los vasos humanos ya sea de la cirugía o donantes aprobados a juego. Con la invención de la técnica de generación iPSC por Shinya Yamanaka, los CE humanos derivados de iPSC se pueden utilizar de forma fiable en experimentos in vitro, como se informó anteriormente¹⁸.

El uso de EC transducidos viralmente con números y pasajes limitados puede ser suficiente para los estudios de señalización, pero para los estudios funcionales, es mejor generar líneas de células madre pluripotentes mutadas , (ya sea iPSCs o hESC dirigidas a CRISPER/Cas9), luego diferenciarlas en EC para estudios de angiogénesis que utilizan ensayos de formación de tubos¹⁹. La formación de tubos se puede utilizar para evaluar la función de las células endoteliales que tienen mutaciones en los rodamientos. Este protocolo también describe la formación de tubos en una placa de angiogénesis de deslizamiento, que es un método fácil, rentable y reproducible.

El protocolo siguiente proporciona un método fiable y sistémico para estudiar el papel de genes específicos en la formación vascular, junto con detalles para el patrón de expresión in vivo y la cuantificación funcional in vitro para el modelado de enfermedades humanas.