عرض هنا هو بروتوكول لكامل جبل في الموقع الحمض النووي الريبي تحليل التهجين في حمار وحشي وأنبوب تشكيل القول في المريض المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستمدة من الخلايا الانبوبية لدراسة دور endoglin في تكوين الأوعية الدموية.
يتم تحديد تطور الأوعية الدموية من خلال التعبير التسلسلي لجينات محددة ، والتي يمكن دراستها من خلال إجراء معينات التهجين في الموقع في سمك الحمار الوحشي خلال مراحل النمو المختلفة. للتحقيق في دور endoglin (eng) في تكوين الأوعية أثناء تطوير telangiectasia النزفية الوراثية (HHT) ، يتم استخدام الضربة القاضية المستهدفة التي تم التوصل إليها بوساطة مورفولينو من المهندس في سمك الحمار الوحشي لدراسة التعبير الزمني والوظائف المرتبطة بها. هنا، يتم استخدام كامل جبل في الموقع التهجين الحمض النووي الريبي (ويش) لتحليل المهندس وجيناته المصب في أجنة حمار وحشي. أيضا، يتم تنفيذ المقالات تشكيل أنبوب في HHT المستمدة من المرضى المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية الخلايا الانبوبية المتمايزة (iPSC-ECs؛ مع الطفرات المهندس). نظام تضخيم إشارة محددة باستخدام كامل المبلغ في التهجين في الموقع – يوفر WISH دقة أعلى ونتائج خلفية أقل مقارنة بالطرق التقليدية. للحصول على إشارة أفضل، يتم ضبط وقت ما بعد التثبيت إلى 30 دقيقة بعد التهجين التحقيق. لأن تلطيخ الفلورليسين ليس حساسًا في أجنة الحمار الوحشي ، يتم استبداله بتلطيخ diaminobezidine (DAB) هنا. في هذا البروتوكول، يتم تمييز خطوط IPSC المشتقة من المرضى HHT التي تحتوي على طفرة في الهندسة في الخلايا الانهوائية. بعد طلاء لوحة مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، يتم زرع iPSC-ECs كطبقة أحادية في الآبار وتبقى عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعة. ثم يتم حساب طول الأنبوب وعدد الفروع باستخدام الصور المجهرية. وهكذا، مع هذا البروتوكول ويش المحسنة، فمن مبين أن انخفاض التعبير المهندس يؤثر على تكوين السلف النهويلي في أجنة حمار وحشي. وهذا ما تؤكده كذلك المقالات التي تستخدم تشكيل الأنبوب باستخدام iPSC-ECs المشتقة من مريض مصاب بHHT. هذه المقالات تؤكد دور المهندس في التنمية الوعائية في وقت مبكر.
وقد تم الإبلاغ عن طفرة واحدة على المهندس (CD105) في المرضى الذين يعانون من HHT. الطفرة يؤدي إلى زيادة انتشار المفوضية الأوروبية والحد من التدفق بوساطة EC الإطالة1,2. كما تم الإبلاغ سابقا أن نقص ENG يقلل من التعبير علامات الانثيلية (أي kdrl، cdh5، hey2)في حمار وحشي3. إندوغلين، وأعرب أساسا في الخلايا البطانة ، هو بروتين الجليكوبروتين عبر الغشاء ويعمل كمستقبلات المشاركة لتحويل عامل النمو α (TGF-α) أفراد الأسرة. وهو يوجه BMP9 ملزمة على سطح الخلية لتنظيم الجين المصب، بما في ذلك التعبير Id1، للحث على تمايز الخلايا الجذعية نحو ECs4. وهكذا، فإن الجين المهندس يلعب أدوارا هامة في تكوين الأوعية الدموية وأمراض الأوعية الدموية البشرية5,6. لقد درسنا في السابق آثار الضربة القاضية endoglin على تكوين السفينة في أجنة حمار وحشي ، تليها تحليل ECs المشتقة من iPSCs المكتسبة من مريض HHT تحمل طفرة المهندس 7. يوضح هذا البروتوكول آثار نقص ENG على تعبير علامة السلف البطاني وتكوين الأنبوب ، وهو طريقة قابلة للقياس الكمي للقياس في تولد الأوعية في المختبر.
لدراسة التعبير المكانية والزمنية ، يتم توظيف WISH للكشف عن التعبير الجيني في الجسم الحي8. في التهجين في الموقع (ISH) هو وسيلة لاستخدام المسابير المسمى مع تسلسل تكملة من الأحماض النووية المستهدفة (الحمض النووي أو مرنا) للكشف عن وتصور الهجينة الحمض النووي الهدف في عينة ثابتة. تعمل العملية على تضخيم إشارات التعبير الجيني في الجسم الحي وتستخدم للكشف عن تعبير الجينات عن طريق المجهر. وقد تم استخدام ويش على نطاق واسع في مختلف الحيوانات نموذج, خاصة في حمار وحشي9. كما أنها تستخدم للحصول على البيانات التالية: 1) أنماط التعبير المكاني/الزماني الجينية، التي توفر معلومات عن وظيفة الجينات وتصنيفها؛ (2) أنماط التعبير المكاني/الزمني، التي توفر معلومات عن وظيفة الجينات وتصنيفها؛ (2) أنماط التعبير المكاني/الزمني، التي توفر معلومات عن وظيفة الجينات وتصنيفها؛ (2) أنماط التعبير المكاني/الزمني، التي توفر معلومات عن وظيفة الجينات وتصنيفها؛ (2) أنماط التعبير المكاني و 2) أعرب على وجه التحديد علامات الجينات التي تستخدم في المخدرات عالية الإنتاجية أو الكشف متحولة10.
يتم تدهور المجسات الكروموجينية بسهولة مع الكروموسوم التقليدي في التهجين في الموقع (CISH) ، مما يؤدي إلى ضوضاء خلفية عالية وإشارات غير محددة11،12. تستخدم طريقة WISH مسبارين مستقلين مزدوجين من Z، تم تصميمهما للتهجين لاستهداف تسلسلات الحمض النووي الريبي. يحتوي كل مسبار على تسلسل 18-25 مكملًا للRNA المستهدف وتسلسل ذيل أساسي 14 (تصور يُنظر إليه على أنه Z). يتم استخدام المسابير المستهدفة في زوج (Z مزدوج). تشكل تسلسلات الذيل معاً موقع تهجين أساسي 28 للمكبر اتّفاً، والذي يحتوي على 20 موقع ربط للمكبر للصوت. مكبر للصوت، بدوره، يحتوي على 20 مواقع ملزمة للتحقيق التسمية ويمكن أن تسفر نظريا ما يصل إلى 8000 تسميات لكل تسلسل الحمض النووي الريبي الهدف.
تسهل هذه التقنية المتقدمة تضخيم الإشارة في وقت واحد وقمع الخلفية لتحقيق التصور أحادي الجزيء مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة13. ويستند مزيد من التعديل من أساليب WISH على البحوث السابقة14، بما في ذلك تثبيت اضافية وتلطيخ DAB. المنصوص عليها هنا هو بروتوكول ويش المحسنة التي يمكن أن تعمل حتى لو انخفض جزئيا الجيش الملكي النيبالي الهدف أو المتدهورة. وتشمل المزايا أنه يمكن إكماله في 24 ساعة دون ظروف خالية من RNase. يمكن أيضًا اكتشاف الإشارات في وقت واحد من خلال قنوات متعددة من أهداف متعددة ، وتكون النتائج متسقة ومتوافقة مع النتائج من منصات أتمتة عالية الإنتاجية مختلفة.
النتائج من النماذج الحيوانية لا تعكس الضرورية نفس الظاهرة التي تحدث في البشر. ENG يحتوي على اثنين من أزواج من السيستينات المحفوظة، C30-C207 و C53-C182، والتي تشكل جسور الكبريتيد في المناطق اليتيمة. لمزيد من الدراسة دور المهندس في المرضى HHT، وقد أجريت المقالات تشكيل أنبوب مع iPSCs المستمدة من المرضى HHT في خلايا دون / مع الطفرات المهندس (Cys30Arg، C30R)15. بعد أن أبلغ كوبوتا وآخرون لأول مرة عن تجربة تشكيل الأنبوب16، تم تطوير السب في عدة طرق. وقد استخدم لتحديد العوامل الوعائية أو المضادة للأنجيوجيوجينية، وتحديد مسارات الإشارات في تولد الأوعية، وتحديد الجينات التي تنظم تولد الأوعية17.
قبل توافر iPSC-ECs المشتقة من المريض، استخدم الباحثون في المقام الأول ECs المستزرعة لدراسة الانجيوجينز16. ومع ذلك ، بالنسبة للخلايا الداخلية ، فإنه يشكل تحديًا تقنيًا للجينات الخارجية العابرة مع الفيروس ، بسبب عدد المرور المحدود الذي يمكن أن تخضع له ECs. وذلك لأنه لا يكاد يكون هناك ما يكفي من المواد الخلوية التي يمكن جمعها من الأوعية البشرية إما من الجراحة أو المتبرعين المعتمدين المتطابقة. مع اختراع تقنية توليد iPSC من قبل شينيا ياماناكا ، يمكن استخدام ECs البشرية المشتقة من iPSCs بشكل موثوق في التجارب المختبرية ، كما ورد سابقًا18.
باستخدام ECs المستحثة فيروسيا مع أعداد محدودة والممرات قد تكون كافية لدراسات الإشارات, ولكن بالنسبة للدراسات الوظيفية, فمن الأفضل لتوليد خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات متحولة, (إما iPSCs أو كريسبر / Cas9-المستهدفة hESCs), ثم تمييزها في ECs لدراسات تولد الأوعية التي تستخدم تشكيل أنبوب المقالات19. يمكن استخدام تشكيل الأنبوب لتقييم وظيفة الخلايا الانبوبية التي تحمل طفرات. يصف هذا البروتوكول أيضًا تكوين الأنبوب على لوحة تولد الأوعية الشرائح، وهي طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للاستنساخ.
يوفر البروتوكول أدناه طريقة موثوقة ومنهجية لدراسة دور جينات محددة في تكوين الأوعية الدموية ، إلى جانب تفاصيل في نمط التعبير الحي وفي المختبر الكمي الوظيفي لنمذجة الأمراض البشرية.
هذا البروتوكول تطبيق تحسين كامل جبل في الموقع RNA منصة تحليل لحمار وحشي وأنابيب تشكيل المقالات على iPSC-ECs المستمدة من مريض HHT. تتطلب طريقة ISH التقليدية دورة تجريبية أطول مع خطوات تجريبية إضافية. البروتوكول لديه بعض التحسينات الهامة، واستخدام مستقلة مزدوجة Z المسابير وiPSCs المستمدة من المريض مع…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل بمنح من البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين – الخلايا الجذعية والبحوث الانتقالية [منحة رقم 2016YFA0102300 (إلى جون يانغ)]؛ مؤسسة علوم الطبيعة في الصين [المنحة رقم 81870051، 81670054 (إلى جون يانغ)]؛ صندوق كامس للابتكار للعلوم الطبية (CIFMS) [منحة رقم 2016-I2M-4-003 (إلى جون يانغ)]؛ تم العثور على شباب PUMC وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية [منحة رقم 2017310013 (إلى فانغ تشو)].
µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |