הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם
Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור כל הר באתרו הכלאה של RNA ניתוח ב-דג זברה והיווצרות שפופרת שיטת החולה-נגזר המושרה תא גזע מתאים הנגזר ללמוד את התפקיד של אנגלין במערך כלי הדם.
Abstract
התפתחות כלי הדם נקבעת על ידי הביטוי הרציף של גנים ספציפיים, אשר ניתן ללמוד על ידי ביצוע היברידיזציה באתרו הכלאה במהלך שלבים התפתחותיים שונים. כדי לחקור את התפקיד של אנדוגלין (eng) במערך הספינה במהלך ההתפתחות של telangiectasia מדמם תורשתי (hht), המוזולסטינו בתיווך ממוקדת ממוקד של eng ב-דג זברה משמשים לחקר הביטוי הזמני שלה פונקציות משויכות. כאן, כל הר של היברידיזציה באתרו (מאחל) הוא מועסק לניתוח של eng ואת הגנים שלה במורד הזרם של עוברי דג דג זברה. כמו כן, היווצרות צינור הרכבת מבוצעים החולה HHT-נגזר המושרה הנגרמת לתאי גזע מובחנים תאים אנדותל (iPSC-ECs; עם מוטציות eng ). אות ספציפית מערכת הגברה באמצעות הסכום כולו היברידיזציה באתרו – משאלה מספקת ברזולוציה גבוהה יותר ותוצאות הרקע התחתון בהשוואה לשיטות המסורתיות. כדי להשיג אות טוב יותר, הזמן לאחר הקיבעון מותאם ל 30 דקות לאחר הכלאה בדיקה. מכיוון שצביעת הקרינה הפלואורסצנטית אינה רגישה בעוברי הדגים, הוא מוחלף בכתמים משובצת יהלומים. בפרוטוקול זה, HHT המטופל נגזר הקווים iPSC המכיל מוטציה eng מובחנים לתאי האנדותל. לאחר ציפוי צלחת עם מטריקס קרום המרתף עבור 30 דקות ב 37 ° c, ipsc-ecs הם שנזרע כמו דופלקס לתוך בארות ושמרו על 37 ° c עבור 3 h. לאחר מכן, אורך הצינור ומספר הענפים מחושבים באמצעות תמונות מיקרוסקופיים. כך, עם הפרוטוקול המשופר הזה משאלה, זה מראה כי מופחתת ביטוי eng משפיע על היווצרות מחולל שורש בתוך העוברים בדגים. זה מאומת נוספת על ידי היווצרות צינור שפופרת באמצעות iPSC-ECs נגזר מטופל עם HHT. האלה מאשרים לאשר את התפקיד עבור eng בפיתוח כלי דם מוקדם.
Introduction
מוטציה אחת ב eng (CD105) דווחה בחולים עם hht. המוטציה מובילה התפשטות EC מוגברת ומופחתת זרימה-1תיווך ECהתארכות 1,2. כמו כן דווח בעבר כי מחסור ב-ENG מפחית את הביטוי של סמנים אנדותל (כלומר, kdrl, cdh5, hey2) ב דג זברה3. אנדוגלין, המתבטא בעיקר בתאי האנדותל, היא גליקופרוטאין טרנסרפינת ופונקציות כקולטן לשינוי גורם הגדילה β (tgf-β) בני משפחה. הוא מכוון BMP9 קשירה על משטח התא כדי לווסת את הגן במורד הזרם, כולל Id1 ביטוי, כדי לגרום לבידול תא גזע לכיוון ecs4. כך, הגן eng משחק תפקידים חשוביםבתוךvasculogenesis ומחלות כלי דם אנושיים 5,6. בדקנו בעבר את ההשפעות של אנדוגלין מלמטה על היווצרות הספינה בעוברי דגים דג זברה, ואחריו ניתוח של ecs iPSCs-נגזר שנרכשו מחולה hht נושאת מוטציה eng 7. פרוטוקול זה מדגים את ההשפעות של המחסור ב-ENG על ביטוי סמן של מחולל קדמון והיווצרות שפופרת, שהיא שיטה הניתנות לכימות למדידת האנגיוגנזה של מבחנה.
כדי ללמוד eng מרחבית הביטוי הזמני, המשאלה מועסק כדי לזהות ביטוי גנים ב vivo8. באתרו היברידיזציה (ISH) היא שיטה של שימוש בבדיקות עם תוויות עם רצפים משלימים של חומצות גרעין היעד (DNA או mRNA) כדי לזהות ולהמחיש את היעד חומצות גרעין כלאיים בדגימה קבועה. התהליך מגביר אותות ביטוי גנים ב vivo והוא משמש כדי לזהות את הביטוי של גנים על ידי מיקרוסקופ. המשאלה היתה בשימוש נרחב בחיות מודל שונות, במיוחד ב דג זברה9. הוא משמש גם כדי לרכוש את הנתונים הבאים: 1) ביטויים מרחביים/זמני גנים, אשר מספקים מידע על פונקציה גנטית וסיווג; ו-2) הביע במפורש סמנים גנים המשמשים בשימוש בתפוקה גבוהה או בסינון מוטציה10.
בדיקות כרומוגניים מושפל בקלות עם כרומוזום מסורתי היברידיזציה באתרו (cish), אשר מביא רעש רקע גבוהואותות לאספציפיים,12. שיטת המשאלה משתמשת בשני בדיקה עצמאית כפולה Z, אשר נועדו לhybridize היעד רצפי RNA. כל בדיקה מכילה רצף 18-25 המשלים ל-RNA היעד ו 14 בסיס הזנב רצף (המשדר כ Z). בבדיקות היעד נעשה שימוש בזוג (כפול Z). שני רצפי הזנב יחד טופס 28 הכלאה בסיס האתר עבור מגבר הקדם, אשר מכיל 20 אתרי מחייב עבור המגבר. המגבר, בתורו, מכיל 20 אתרי קשירה עבור בדיקה התווית והוא יכול תיאורטית להניב עד 8,000 תוויות עבור כל מטרה RNA רצף.
טכנולוגיה מתקדמת זו מאפשרת הגברה זמנית של אותות ודיכוי רקע כדי להשיג הדמיה חד-מולקולות תוך שמירה על מורפולוגיה של רקמות13. שינוי נוסף של שיטות המשאלה מבוסס על מחקר הקודם14, כולל קיבעון נוסף וכתמים מכתים. בתנאי כאן הוא פרוטוקול משאלה משופרת שיכול לעבוד גם אם RNA היעד הוא ירד או מושפל חלקית. היתרונות כוללים כי ניתן להשלימה 24 שעות ללא RNase-ללא תנאים. ניתן גם לזהות אותות בו באמצעות ערוצים מרובים מיעדים מרובים, והתוצאות עקביות ותואמות לתוצאות של פלטפורמות אוטומציה שונות בתפוקה גבוהה.
תוצאות מדגמי בעלי חיים אינם נחוצים לשיקוף התופעה המתרחשת אצל בני האדם. ב-ENG מצויים שני זוגות של ציסטרינס, C30-C207 ו-C53-C182, היוצרים גשרים דיגוניים באזורים היתומים. כדי ללמוד עוד יותר את התפקיד של eng ב-hht חולים, היווצרות tube בחני עם iPSCs נגזר מהחולים hht בוצעו בתאים ללא/עם מוטציות eng (Cys30Arg, C30R)15. לאחר שקוביטה ואח ‘ דיווח תחילה על היווצרות הצינור בניסוי16, המבנה פותח במספר דרכים. הוא משמש כדי לזהות גורמים אנגיוגנטיים או אנטי-אנגיוגנטיים, להגדיר את מסלולים איתות באנגיוגנזה, ולזהות גנים המסדירים אנגיוגנזה17.
לפני הזמינות של iPSC-ECs המטופל, החוקרים השתמשו ECs תרבותי בעיקר כדי ללמוד angiogensis16. עם זאת, עבור תאי האנדותל, זהו אתגר טכני כדי לשנות גנים אקסוגני עם וירוס, בגלל מספר מעבר מוגבל ECs יכול לעבור. הסיבה לכך היא בקושי מספיק חומר הסלולר כדי לאסוף מכלי הדם או מהניתוח או תורמים שאושרו בהתאמה. עם ההמצאה של טכניקת הדור iPSC ידי שינא יאמאנאקה, ECs האדם נגזר iPSCs יכול לשמש באופן אמין בניסויים מבחנה, כפי שדווח בעבר18.
שימוש ב-ecs התמרה ויראלי עם מספרים מוגבלים ומעברים עשוי להיות מספיק עבור מחקרים איתות, אבל עבור מחקרים פונקציונליים, עדיף ליצור שורות של תא גזע המוטציות pluripotent (או iPSCs או כריסי/Cas9-ממוקד hESCs), ואז להבדיל אותם ל-ecs למחקרים אנגיוגנזה להשתמשבחניהיווצרות שפופרת היווצרות צינור ניתן להשתמש כדי להעריך את הפונקציה של תאים אנדותל הנושאת מוטציות. פרוטוקול זה מתאר גם את היווצרות הצינורית על צלחת האנגיוגנזה של μ-שקופית, המהווה שיטה קלה, חסכונית ומתוכבת.
הפרוטוקול המופיע להלן מספק שיטה אמינה ומערכתית ללימוד התפקיד של גנים ספציפיים במערך כלי הדם, יחד עם פרטים על תבנית ביטוי vivo ובכמת מחוץ לגוף לצורך דוגמנות מחלות אנושיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הוחל שיפור משופר הר הפלטפורמה באתרו של ה-RNA פלטפורמת היווצרות שפופרת של דג ומערכת צינור על iPSC-ECs נגזר מחולה HHT. שיטת ISH המסורתית מחייבת מחזור ניסיוני ארוך יותר עם צעדים ניסיוניים נוספים. הפרוטוקול יש כמה שיפורים חשובים, השימוש של בדיקה עצמאית כפולה Z ו iPSCs נגזר ממטופל עם hht שהוחלו ב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי מענקים מתוכנית המחקר ופיתוח של המפתח הלאומי של סין, תאי גזע ומחקר טרנסלtional [מספר 2016YFA0102300 (כדי יוני יאנג)]; הקרן למדעי הטבע של סין [גרנט מספר 81870051, 81670054 (ליוני יאנג)]; קרן חדשנות מצלמות למדעי הרפואה (CIFMS) [גרנט מספר 2016-I2M-4-003 (כדי יוני יאנג)]; הנוער PUMC נמצא ואת קרנות המחקר הבסיסי של האוניברסיטאות המרכזיות [מספר 2017310013 (לפאנג ג’ואו)].
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish – implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. 发育生物学. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
