Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Una singola mutazione su eng (CD105) è stata segnalata in pazienti con HHT. La mutazione porta ad un aumento della proliferazione CE e alla riduzione dell’allungamento CE mediato dal flusso^1,2. È stato anche riferito in precedenza che la carenza di ENG riduce l’espressione dei marcatori endoteliali (cioè kdrl, cdh5, hey2) nel pesce zebra³. L’endoglin, espresso principalmente nelle cellule endoteliali, è una glicoproteina transmembrana e funziona come co-recettore per trasformare i membri della famiglia del fattore di crescita . Dirige il legame BMP9 sulla superficie cellulare per regolare il gene a valle, compresa l’espressione Id1, per indurre la differenziazione delle cellule staminali verso EC⁴. Così, il gene eng svolge ruoli importanti nella vasculogenesi e nella malattia vascolare umana^5,6. In precedenza abbiamo esaminato gli effetti del knockdown endoglin sulla formazione dei vasi negli embrioni di pesce zebra, seguito dall’analisi delle EC derivate da iPSC acquisite da un paziente HHT con una mutazione di eng ⁷. Questo protocollo dimostra gli effetti della carenza di ENG sull’espressione del marcatore del progenitore endoteliale e sulla formazione di tubi, che è un metodo quantificabile per misurare l’angiogenesi in vitro.

Per studiare l’espressione spaziale e temporale, WISH viene impiegato per rilevare l’espressione genica in vivo⁸. L’ibridazione in situ (ISH) è un metodo di utilizzo di sonde etichettate con sequenze complementari di acidi nucleici bersaglio (DNA o mRNA) per rilevare e visualizzare ibridi di acido nucleico bersaglio in un esemplare fisso. Il processo amplifica i segnali di espressione genica in vivo e viene utilizzato per rilevare l’espressione dei geni mediante microscopia. WISH è stato ampiamente utilizzato in vari animali modello, soprattutto nel pesce zebra⁹. È anche usato per acquisire i seguenti dati: 1) modelli di espressione campionaria/temporale, che forniscono informazioni sulla funzione genica e sulla classificazione; e 2) marcatori genici specificamente espressi che vengono utilizzati in farmaci ad alto consumo o screening^{mutante 10}.

Le sonde cromogeniche sono facilmente degradate con l’ibridazione tradizionale in situ (CISH) cromosomica in situ, che si traduce in un rumore di fondo elevato e segnali non specifici^11,12. Il metodo WISH utilizza due sonde doppie indipendenti, che sono progettate per ibridarsi per indirizzare le sequenze di RNA. Ogni sonda contiene una sequenza di 18-25 complementare all’RNA bersaglio e una sequenza di coda di base di 14 (concettualizzata come z). Le sonde di destinazione vengono utilizzate in una coppia (doppio) . Le due sequenze di coda formano insieme un sito di ibridazione di base 28 per il preamplificatore, che contiene 20 siti di binding per l’amplificatore. L’amplificatore, a sua volta, contiene 20 siti di legame per la sonda di etichette e può teoricamente produrre fino a 8.000 etichette per ogni sequenza di RNA bersaglio.

Questa tecnologia avanzata facilita l’amplificazione simultanea del segnale e la soppressione dello sfondo per ottenere la visualizzazione a singola molecola, preservando la morfologia dei tessuti¹³. Ulteriore modifica dei metodi WISH si basa su precedenti ricerche¹⁴, tra cui fissazione supplementare e colorazione DAB. A condizione qui è un protocollo WISH migliorato che può funzionare anche se l’RNA bersaglio è parzialmente diminuito o degradato. I vantaggi includono che può essere completato in 24 h senza condizioni RNase-free. I segnali possono anche essere rilevati simultaneamente attraverso più canali da più destinazioni e i risultati sono coerenti e compatibili con i risultati di diverse piattaforme di automazione ad alta velocità effettiva.

I risultati dei modelli animali non riflettono il fenomeno che si verifica nell’uomo. ENG contiene due coppie di cistein conservi, C30-C207 e C53-C182, che formano ponti disulfide nelle regioni orfane. Per studiare ulteriormente il ruolo di eng nei pazienti affetti da HHT, i saggi di formazione dei tubi con iPSC derivati da pazienti HHT sono stati effettuati in cellule senza/con mutazioni di eng (Cys30Arg, C30R)¹⁵. Dopo Che Kubota et al. ha riportato per la prima volta l’esperimento di formazione dei tubi¹⁶, il saggio è stato sviluppato in diversi modi. È stato utilizzato per identificare fattori angiogenici o antiangiogenici, definire le vie di segnalazione nell’angiogenesi e identificare i geni che regolano l’angiogenesi¹⁷.

Prima della disponibilità di iPSC-EC derivati dai pazienti, i ricercatori hanno utilizzato principalmente le EC coltivate per studiare l’angiogenesi¹⁶. Tuttavia, per le cellule endoteliali, è una sfida tecnica trasdurre geni esogeni con un virus, a causa del numero di passaggio limitato che le EC possono subire. Questo perché non c’è quasi abbastanza materiale cellulare da raccogliere da vasi umani sia da un intervento chirurgico o da donatori approvati corrispondenti. Con l’invenzione della tecnica di generazione iPSC da shinya Yamanaka, gli EC umani derivati dagli iPSC possono essere utilizzati in modo affidabile in esperimenti in vitro, come riportato in precedenza¹⁸.

Utilizzando EC viralmente trasdotti con un numero limitato di e passaggi può essere sufficiente per gli studi di segnalazione, ma per gli studi funzionali, è meglio generare linee di cellule staminali pluripotenti mutanti (o iPSC o HESC mirati a CRISPER/Cas9), quindi differenziarli in EC per gli studi di angiogenesi che utilizzano saggi di formazione dei tubi¹⁹. La formazione del tubo può essere utilizzata per valutare la funzione delle cellule endoteliali con mutazioni. Questo protocollo descrive anche la formazione di tubi su una piastra di angiogenesi, che è un metodo facile, conveniente e riproducibile.

Il protocollo seguente fornisce un metodo affidabile e sistemico per studiare il ruolo di geni specifici nella formazione vascolare, insieme a dettagli per il modello di espressione in vivo e la quantificazione funzionale in vitro per la modellazione della malattia umana.