Summary

Profilage du complexome haute résolution par cryoslicing BN-MS Analysis

Published: October 15, 2019
doi:

Summary

Un protocole de cryoslicing polyvalent BN-MS utilisant un microtome est présenté pour le profilage complexome à haute résolution.

Abstract

Les protéines exercent généralement des fonctions biologiques par des interactions avec d’autres protéines, soit dans des assemblages de protéines dynamiques, soit dans le cadre de complexes formés de façon stable. Ce dernier peut être élégamment résolu selon la taille moléculaire en utilisant l’électrophoresis indigène de gel de polyacrylamide (BN-PAGE). L’accouplement de ces séparations à la spectrométrie de masse sensible (BN-MS) a été bien établi et permet théoriquement une évaluation exhaustive du complexe extractible dans des échantillons biologiques. Cependant, cette approche est plutôt laborieuse et fournit une résolution et une sensibilité de taille complexes limitées. En outre, son application est restée limitée aux protéines mitochondriales et plastides abondantes. Ainsi, pour la majorité des protéines, l’information concernant l’intégration dans des complexes protéiques stables fait encore défaut. Présenté ici est une approche optimisée pour le profilage complexome comprenant la séparation BN-PAGE à l’échelle préparative, l’échantillonnage sous-millimètre de larges voies de gel par le criblage cryomicrotome, et l’analyse spectrométrique de masse avec la quantification sans étiquette de protéine. Les procédures et les outils pour les étapes critiques sont décrits en détail. En tant qu’application, le rapport décrit l’analyse complexome d’une fraction de membrane endosome-endosome-endosome-enrichie de reins de souris, avec 2.545 protéines profilées au total. Les résultats démontrent l’identification des protéines membranaires uniformes et à faible abondance telles que les canaux ioniques intracellulaires ainsi que des modèles complexes d’assemblage de protéines à haute résolution, y compris les isoformes de glycosylation. Les résultats sont en accord avec des analyses biochimiques indépendantes. En résumé, cette méthodologie permet une identification complète et impartiale des protéines (super)complexes et de leur composition sous-unité, fournissant une base pour étudier la stoichiométrie, l’assemblage et la dynamique d’interaction des complexes protéiques dans système biologique.

Introduction

La séparation BN-PAGE a d’abord été directement couplée à l’analyse LC-MS (BN-MS) par les groupes de recherche Majeran1 et Wessels2 à l’aide de découpemanuels des voies de gel BN-PAGE. Leurs analyses ont identifié un certain nombre de complexes protéiques membranaires abondants avec la composition connue de sous-unité des plastides végétaux et des mitochondries cellulaires HEK, respectivement. Toutefois, ces analyses étaient loin d’être exhaustives et ne permettaient pas d’identifier de nouvelles assemblées de façon impartiale. Les performances des spectromètres de masse et des méthodes de quantification sans étiquette se sont considérablement améliorées depuis, ce qui a permis des analyses complètes du BN-MS. Cela a inventé le terme «profilage complexe». Par exemple, Heide et ses collègues ont analysé les mitochondries cardiaques du rat, identifiant et regroupant 464 protéines mitochondriales, confirmant ainsi de nombreux assemblages connus. En outre, ils ont trouvé TMEM126B comme une sous-unité nouvelle et cruciale d’un complexe d’assemblage spécifique3. Des résultats comparables (avec 437 profils de protéines mitochondriales) ont été obtenus dans une étude parallèle des mitochondries des cellules HEK4.

Malgré ces améliorations, plusieurs questions sont demeurées qui limitent le plein potentiel de BN-MS pour le profilage complexome. Une limitation majeure est la résolution de taille effective des complexes qui est déterminée par deux facteurs : la (i) qualité de la séparation BN-PAGE, qui dépend de l’uniformité du gradient de pores de matrice de gel ainsi que de la stabilité/solubilité des complexes d’échantillon, et (ii) la taille d’étape de l’échantillonnage de gel, qui est au mieux 1 mm en utilisant le criage manuel conventionnel5,6. La mauvaise résolution de taille manque non seulement les isoformes et les hétérogénéités complexes subtiles, mais elle affecte également négativement la gamme dynamique et la confiance de l’affectation et de la quantité impartiaux de subunit de novo.

D’autres défis incluent la précision de la quantification des protéines et la couverture de la gamme dynamique réelle des abondances de protéines dans l’échantillon par analyse spectrométrique de masse. Par conséquent, l’application du profilage du complexe BN-MS est demeurée en grande partie limitée aux échantillons biologiques présentant une complexité plus faible, une expression élevée des complexes cibles et des propriétés favorables de solubilisation (c.-à-d. plastides, mitochondries et micro-organismes)6,7,8,9,10.

Nous avons récemment introduit le BN-MS (csBN-MS) assisté par cryomicrotome, qui combine un échantillonnage précis de voies de gel BN-PAGE sous-millimétriques avec une analyse complète de la SP et un traitement élaboré des données sur la SP pour déterminer les profils protéiques à haute confiance11. L’application à une préparation mitochondriale de membrane des cerveaux de rat a démontré la résolution efficace précédemment non satisfaite de taille complexe et la couverture maximale des sous-unités oxydantes de chaîne respiratoire (OXPHOS) (c.-à-d., 90 de 90 MS-accessible). Cet exemple a également permis d’identifier un certain nombre de nouveaux assemblages de protéines.

Décrits ici sont des procédures optimisées pour la séparation à l’échelle préparative BN-PAGE des complexes protéiques (non limité à une source biologique particulière), la coulée de grands gels préparatifs BN-PAGE, le découpage cryomicrotome de larges voies de gel, et les données de SP traitement. La performance du profilage à haute résolution est démontrée pour une préparation complexe de protéine des membranes endosome-enrichies de rein de souris. Enfin, les avantages d’une résolution et d’une précision accrues de la quantification spectrométrique de masse sont discutés.

Protocol

1. Bn-PAGE préparatif Préparation de gel Utilisez un système d’électrophoresis de gel vertical de format moyen à grand (distance de séparation du gel de 10 cm; 14 cm x 11 cm, espaceur de 1,5 mm) avec un refroidissement efficace réglé à 10 oC. Cast gel linéaire ou hyperbolique de gradient de pores (1.5-3.0 mm d’espaceurs) à l’aide d’un mélangeur à gradient à deux chambres en mouvement entraîné par une pompe (voir Tableau des matériaux et des réactifs). Dans l’exemple présenté (gel de gradient linéaire 1%-13%): Préparer une solution de 13 ml pour la chambre avant (mélange) composée de : 13 % d’acrylamide (à partir de 30 % de la solution de stock, 37,5:1,0 acrylamide:bisacrylamide), 0,75 M d’acide aminocaproïque, 50 mM bis-tris (pH à 7,0) et 10 % de glycérol. Préparer une solution de 10 ml pour la chambre du réservoir composée de: 1% d’acrylamide (à partir de 30% de solution de stock, 37,5:1.0 acrylamide:bisacrylamide), 0,75 M d’acide aminocaproïque, 50 mM Bis-Tris (pH – 7,0), et 0,2% de détergent CL-47. Démarrer l’agitateur et ajouter 30 microlitres d’APS (ammonium peroxodisulfate, solution de stock de 10%) et 2,5 L de TEMED (N,N’,N’,N’,N’-téramethyl éthyle) et 2,5 microlitres de TEMED à la solution dans la chambre avant. Démarrer la pompe et ouvrir la soupape avant (le débit doit être ajusté pour terminer la coulée en 10 min). Après 1 min, ajouter 90 L d’APS et 5 L de TEMED à la solution dans la chambre du réservoir et ouvrir la connexion de la chambre. Laisser le gel polymériser lentement mais soigneusement pendant au moins 24 h à température ambiante (RT) pour générer un gradient homogène de taille de pores. Lorsqu’il est conservé humide, le gel polymérisé peut être maintenu à la verticale à 4 oC pendant une semaine.REMARQUE : Intentionnellement, le dessus du gel aura une consistance douce/mince. Cela sera plus tard enlevé, mais permet l’entrée en douceur des protéines dans le gel, avec un risque minimal de précipitations protéiques qui pourraient autrement conduire à des artefacts de migration (c.-à-d., stries ou précipitations protéiques). Préparation et chargement d’échantillons Préparer les emplacements de chargement en insérant des espaceurs appropriés (p. ex. tubes de silicium) entre les plaques de verre pour séparer 0,5 à 2,0 mg de protéines. Les fentes doivent être faites au moins 3 cm de large (ou mieux, 5-6 cm de large). Solubilize 2,5 mg de membrane (préparation endosome-endosome-endosome-endosome de souris) dans 2 ml de tampon de solubilisation contenant 1% (w/v) détergent non dénaturant (ComplexioLyte CL-47) pendant 30 min sur la glace. Ultracentrifugate (coupure de sédimentation 200 S ou moins; 130 000 x g/11 min est utilisée ici). Concentrez le solubilisate sur un court 50%/20% (w/v, 0.3 ml chacun) gradient d’étape de saccharose par ultracentrifugation pendant 1 h à 400.000 x g. Le rendement protéique final devrait être d’au moins 1 mg. Ajouter 0,05 % (w/v) Coomassie G-250 au solubilisate et charger l’échantillon sur le gel. Limitez la charge protéique à une section transversale de 10 à 15 g/mmde voie de gel pour obtenir une haute résolution et éviter les artefacts résultant des précipitations protéiques. Conditions de fonctionnement BN-PAGE Pour les tampons de fonctionnement, préparez un tampon cathodique standard composé de 50 mM de tricine, 15 mM Bis-Tris et 0,01 % Coomassie G-250. Préparer un tampon d’anode standard composé de 50 mM bis-tris (pH 7,0). Exécuter un BN-PAGE préparatif à 10 oC pendant la nuit à l’aide d’un protocole de tension en trois étapes13 composé de : une phase d’équilibre de 30 min à 100 V, puis une rampe lente (3 h) à la tension maximale (40-50 V/cm longueur de gel) qui est finalement maintenue pendant au moins 6 h pour mise au point de terminaison des protéines.REMARQUE : Il est recommandé de mettre en pause l’électrophorèse lorsque le front de migration a atteint le milieu du gel et d’échanger le tampon cathodique contre du tampon frais sans Coomassie G250. Cela permet d’éviter les artefacts de précipitation dans le gel résultant de l’effondrement local de la structure des pores de matrice. 2. Échantillonnage et digestion de gel Excision des voies de gel Après la course, scanner les gels à des fins de documentation tout en les gardant entre les plaques de verre. Démonter les plaques et exciser la section de voie (s) d’intérêt. Prenez une bande d’échantillon de la voie pour analyse par 2D BN/SDS-PAGE et coloration des protéines ou des ballonnements occidentaux (comme le montre la figure 1B) afin de déterminer les régions d’intérêt, la résolution efficace de la taille complexe et l’abondance des protéines. Fixer deux fois des voies de gel sélectionnées pendant au moins 30 min avec 30 % (v/v) d’éthanol et 15 % (v/v) d’acide acétique. Transférer l’échantillon dans le milieu d’intégration et lui permettre de tremper et d’équilibrer pendant au moins 2 h à 4 oC, tout en gardant la dalle de gel au ralenti sur un shaker orbital.REMARQUE : La séparation du gel doit être soigneusement inspectée pour la qualité globale de la séparation et les artefacts de migration. Les bandes de gel représentant les protéines dominantes doivent être sans distorsion et homogènes en intensité. Les artefacts locaux sur le gel doivent être excisés ou exclus de l’analyse. Enchâssement et tranchage de cryomicrotomeREMARQUE : Il s’agit d’une version améliorée de la procédure d’intégration décrite et photo-documentée précédemment qui permet l’incorporation et le découpage des voies plus larges de gel de jusqu’à 8 cm11. Tout d’abord, couper les voies fixes de gel en sections (ici, 3 cm) exactement parallèles au modèle avant/bande de migration de protéine. Pour une manipulation plus facile, placez chaque section sur un support de film plastique avec des dimensions égales. Transférer les voies dans un tube ouvert avec des bouchons (fermés sur le fond, perforés centralement sur le dessus, à la fois précisément alignés avec les extrémités supérieure et inférieure de la section de gel). Trempez brièvement le cylindre dans l’azote liquide pour initier rapidement la solidification. Le milieu transparent d’intégration se solidifie en quelques secondes et devient blanc en couleur. Remplissez la cavité d’un milieu d’intégration, trempez-la brièvement dans de l’azote liquide et congelez le cylindre à -20 oC pendant plusieurs heures.REMARQUE : Refroidir le cylindre rapidement en le trempant dans de l’azote liquide permet d’éviter le déplacement de la dalle de gel dans le tube. La distorsion doit être évitée pour assurer une résolution élevée dans l’analyse suivante de la SP. Après le démontage, retirez le film plastique et transférez le bloc avec la section de gel incorporée à un cylindre en métal refroidi, plus grand, placé sur un support plat (c.-à-d., plat Petri) et scellé avec le milieu d’intégration à l’extérieur du cylindre. Remplir le cylindre d’un milieu d’intégration et congeler soigneusement. Répétez cette procédure avec l’autre côté du cylindre pour obtenir un bloc solide avec des surfaces coplanaires. Retirez le bloc du cylindre, collez-le avec un milieu d’intégration sur un support métallique prérefroidi et insérez le support dans la machine cryoslicing (cryotome). La surface du bloc doit être soigneusement alignée en ce qui concerne le plan de tranchage. Laissez-le acquiescer à la température optimale pour le processus de tranchage (ici, -15 oC).REMARQUE : Utilisez un cycle de découpe manuel le plus lent de la taille de l’étape de 0,1 mm jusqu’à ce qu’il touche la surface de la section de gel intégrée pour assurer un positionnement correct. Récoltez les tranches de gel les unes après les autres, avec une épaisseur finale désirée de 0,25 mm de taille d’étape, et transférez-les individuellement aux tubes de réaction avec des propriétés de liaison à faible teneur en protéines.REMARQUE : Dans cette configuration, les tranches de gel uniformes peuvent être facilement obtenues aussi minces que 0,1 mm et aussi épaisses que 0,5 mm. Digestion tryptique Effectuer la digestion tryptique in-gel après un lavage intensif des tranches de gel (au moins trois tours supplémentaires de lavage sont recommandés pour enlever les composants polymères du milieu d’intégration) suivant une procédure standard11. Peptides élingées à l’assèchement et redissolution en acide trifluoracétique de 0,5 % (v/v) en secouant à 37 oC (10 min) suivi de la sonication du bain (5 min) et d’une brève centrifugation. 3. Spectrométrie de masse nanoHPLC et MS set-up Chargez des échantillons digérés sur une précolonne C18 (taille des particules de 5 m; diamètre de 300 m) avec 0,05 % (v/v) acide trifluroacétique à l’aide d’un nano-HPLC (sans fractionnement) couplé à un spectromètre de masse à haute résolution. Élute a capturé des peptides avec un gradient aqueuse-organique (éluence A): 5 min 3% B, 120 min de 3% B à 30% B, 20 min de 30% B à 99% B, 5 min 99% B, 5 min de 99% B à 3% B, 15 min 3% B (taux de débit 300 nL/min).REMARQUE : Les tranches de gel csBN-MS donnent généralement lieu à des échantillons dont l’abondance de peptides est faible à intermédiaire et un degré limité de complexité. l’analyse nanoLC-MS/MS devrait donc être effectuée avec une configuration offrant une sensibilité raisonnable et une vitesse de séquençage, une résolution de masse élevée (100 000 euros) et une plage dynamique maximale (en fait 3-4 ordres de grandeur). Cependant, il ne nécessite pas de longues dimensions de colonne ou des gradients d’élution étendus au-delà de 3 h. Des peptides élichés séparés dans un émetteur (c.-à-d. 75 m; pointe de 8 m) emballés manuellement d’environ 20 cm avec du matériau C18 (taille des particules à 3 m). Électrospray les échantillons à 2,3 kV (mode ion positif) dans le capillaire de transfert chauffé (250 oC) du spectromètre de masse. Effectuer des analyses avec les réglages d’instruments suivants11: temps d’injection maximum De SP/MS de 400 m; durée d’exclusion de 60 s; seuil de signal minimum : 5 000 dénombrements, 10 principaux précurseurs fragmentés; largeur d’isolement à 1,0 m/z).REMARQUE : Pour faciliter l’étalonnage de la masse, le temps de rétention et l’attribution des signaux peptidiques dans un grand nombre d’ensembles de données ou de mesures, il est recommandé d’effectuer des séries de mesures respectives de la SP sans interruptions ni changements dans les paramètres et le matériel ( c’est-à-dire sur la même colonne C18/émetteur). Identification des protéines (données de La SP évaluées comme décrite précédemment11) Extraire des listes de pics à partir de spectres d’ions fragmentàens à l’aide de l’outil “msconvert.exe” (une partie de ProteoWizard). Déplacez toutes les valeurs précurseurs m/z pour chaque jeu de données par le décalage médian m/z de tous les peptides attribués aux protéines dans une recherche préliminaire de base de données avec une tolérance de masse peptidique de 50 ppm. Recherchez les listes de pics corrigées avec un moteur de recherche approprié (ici, Mascot 2.6.2) contre toutes les entrées de souris de la base de données UniProtKB/Swiss-Prot (sortie 2018-11). Sélectionnez “Acetyl (Protein N-term)”, “Carbamidomethyl (C)”, “Gln pyro-Glu (N-term Q), Glu pyro-Glu (N-term E)”, “Oxidation (M)”, et “Propionamide (C)” comme modifications variables. Définir la tolérance de masse du peptide et du fragment à 5 ppm et 0,8 Da, respectivement, et permettre un clivage tryptique manqué. Définir le seuil de valeur prévu pour l’identification des peptides à 0,5 ou moins. Utilisez une recherche de base de données de leurres pour déterminer le taux de découverte faussement positif (FDR). Fixer le FDR à 1% ou appliquer des critères de qualité supplémentaires pour assurer une identification fiable.REMARQUE : L’expérience présentée a permis d’identifier plus de 3 500 protéines, avec un FDR peptide moyen de 4,4 à 0,77 % (n – 101 échantillons de tranches), ou 3 000 protéines lorsque le Peptide FDR a été fixé à 1 %. Fait important, des critères plus stricts ont été utilisés pour la sélection des protéines profilées (2 568). Il comprenait toutes les protéines qui ont été identifiées avec au moins deux peptides, au moins l’un d’eux étant spécifique aux protéines, dans au moins un des 101 échantillons de tranches. Quantification des protéines Utilisez des intensités de signal peptide (volumes de pointe [PV]) pour la quantité de protéines qui sont obtenues à partir de scans complets FT et correctes pour le temps de rétention et les décalages de masse à l’aide d’un logiciel approprié (ici, MaxQuant v1.6.3). Harmonisez les ensembles de données Sur la SP un par un aux temps d’élution peptidique de référence (moyenne totale) à l’aide de la régression LOESS. Attribuez les PV aux peptides soit directement (identification basée sur la SP/MS) ou indirectement (c.-à-d. en fonction de leur temps d’élution et de m/z correspondant dans des tolérances très étroites).REMARQUE : Ce protocole utilise un logiciel interne pour l’attribution des peptides « insérés ». Les paramètres de l’ensemble donnent lieu à des tolérances efficaces de m/z et de temps d’élution correspondant à des tolérances de 2 ppm et de 1 min, respectivement (voir la figure 2A,B). Corriger les variations systématiques de la charge peptidique et de l’efficacité de l’ionisation par redimensionnement de l’intensité des peptides calculées à partir des différences médianes d’intensité sépariane relative entre les échantillons de tranches voisines (Figure 2C). Filtrer les données PV pour les valeurs aberrantes et les affectations restantes faussement positives identifiées par l’analyse interne de cohérence PV. Normaliser les PV de chaque peptide à leurs valeurs maximales sur tous les ensembles de données de tranches donnant des profils relatifs d’abondance de peptides. Enfin, calculez les profils relatifs d’abondance des protéines en moyenne d’au moins deux (et jusqu’à six ou 50 %, quelle que soit la valeur supérieure) des profils de peptides les plus corrélés sur une fenêtre de trois tranches consécutives. Cela permet de combler les valeurs PV manquantes et de réduire le bruit.REMARQUE : Cela a finalement donné lieu à 2 545 profils protéiques (sur 2 568 présélectionnés)(figure 2D). Caractérisation des complexes protéiques Analyser les profils protéiques en effectuant la première détection de pointe à l’aide de la méthode des maxima locaux, et s’adapter consécutivement à des distributions normales à ces pics, donnant la position (c.-à-d., indice de tranche ou taille complexe apparente) de leurs maxima et FWHM (pleine largeur à demi-intensité maximale) (enset de la figure 4).REMARQUE : Dans le jeu de données, les profils sont analysés automatiquement à l’aide de scripts personnalisés. Les plus petites valeurs FWHM sont indicatives de la résolution de taille efficace de l’approche (ici, 6 x 0,25 x 1,5 mm). Utiliser des pics complexes protéiques de référence avec une masse moléculaire définie (tel que rapporté dans la base de données UniProtKB/Swiss-Prot) pour l’analyse linéaire de la régression des valeurs du journal10 (masse moléculaire prévue) pour convertir les indices de nombre de tranches en tailles moléculaires apparentes (c.-à-d., taille complexe apparente en kDa).REMARQUE : 23 complexes de marqueurs de l’échantillon ont été sélectionnés dans cette étude (figure 4) en fonction (i) des formes monodispersées des pics de profil, (ii) du soutien expérimental des poids moléculaires et (iii) des distributions le long des sections de gel BN-PAGE étudiées.

Representative Results

La grande majorité des études conventionnelles de BN-MS ainsi que l’approche csBN-MS à haute résolution récemment établie ont été appliquées aux préparations mitochondriales et plastides qui sont (i) facilement disponibles, (ii) ont une complexité limitée, et (iii) expriment complexes protéiques cibles (membranes) à forte densité. Ce protocole étend l’application du profilage du complexome à haute résolution aux membranes non mitochondriales exprimant des protéines peu abondantes, sur lesquelles peu d’informations sur leur intégration dans les complexes sont disponibles. À des fins de démonstration, nous avons choisi une préparation de membrane endosome-enrichie du rein de souris obtenu par centrifugation de gradient de densité. L’optimisation de cette préparation a été guidée par la protéine marqueur TPC1 qui forme des canaux ioniques intracellulaires principalement localisés aux endosomes précoces et de recyclage12. Il est également fortement exprimé dans les cellules tubulaires proximales rénales, comme le montre l’analyse immunohistochimique des sections de tissu rénal (Figure 1A). Ces membranes ont été doucement solubilisées (ComplexioLyte 47 à un faible rapport protéine/détergent de 1:8) et concentrées sur un coussin de saccharose par ultracentrifugation. Cette dernière s’est avérée être une étape importante pour éliminer l’excès de composants de poids moléculaire inférieur (c.-à-d. détergents, lipides, sels, polymères organiques et métabolites) qui ont tendance à avoir un impact négatif sur la résolution des séparations préparatives de BN-PAGE. La séparation complexe sur un gel de gradient polyacrylamide natif de 1 % à 13 %(w/v) (figure 1B, panneau moyen) a montré des bandes protéiques fortement tachées avec très peu d’artefacts de migration. La séparation SDS-PAGE d’une bande étroite de gel BN-PAGE(figure 1B, cadre en boîte en rouge) comme deuxième dimension suivie d’une analyse de tache occidentale a montré un modèle bien résolu de populations complexes distinctes associées au TPC1(figure 1B , panneau supérieur, marqué par des flèches rouges), probablement résultant de l’association avec des sous-unités protéiques supplémentaires et/ou des modifications post-traductionnelles (comme la glycosylation12). Une section d’intérêt de 3 cm a été excisée, fixe et traitée pour le découpage de cryomicrotome tel que décrit11. Les étapes individuelles de cette procédure (en particulier, l’alignement précis de la section de gel large), qui est d’une importance critique pour préserver la résolution lors de l’échantillonnage, sont documentées dans la vidéo d’accompagnement. La section de gel incorporée a finalement été découpée en 101 tranches de gel d’une épaisseur uniforme de 0,25 mm(figure 1B, panneau inférieur), qui ont été digérées séparément et analysées par une spectrométrie de masse couplée l.C.LC haute performance. En plus de la résolution de taille, la qualité de la quantification de protéine est la clef pour le profilage réussi de complexome. Avec la configuration et les paramètres de SP utilisés, l’analyse des échantillons a été assez complète, ce qui a permis d’identifier en moyenne plus de 1 000 protéines et 10 000 peptides (dont 8 200 protéinés) par tranche, et environ 3 000 protéines et 43 000 peptides (38 500 d’entre eux étaient protéiques) au total. Néanmoins, en raison de la nature stochastique du séquençage MS/MS dépendant des données et de ses limites dans l’aire de répartition dynamique, l’information sur l’intensité était encore fragmentaire pour les protéines moins abondantes. Par conséquent, une procédure de traitement des données de la SP11a été effectuée qui est basée sur l’attribution précise des signaux peptidiques (volumes de pointe [PV] – intensités de signaux liées au peptide intégrées sur m/z et temps) sur toute la série de jeux de données. Comme le montre la figure 2A,B, les écarts des signaux peptidiques dans le temps de conservation et de masse qui sont restés après l’étalonnage étaient identiques pour les PV assignés à la SP et pour les PV assignés indirectement (avec des tolérances très étroites de ‘lt;1 ppm et ‘lt;0.5 min pour 95% de les PV), indicatif d’un taux très bas pour l’affectation PV faussement positive. Les valeurs aberrantes restantes ont été filtrées en fonction de leur cohérence avec d’autres PV connexes. Étant donné que toutes les mesures de La MS ont été effectuées consécutivement sur la même configuration LC-MS sans modification des paramètres ou des composants matériels, les variations de run-to-run (déterminées comme médiane de toutes les intensités PV dans un échantillon par rapport à celles des tranches voisines) ont été petites et facilement éliminées par la mise à l’échelle des jeux de données PV (figure 2C). L’information d’intensité peptide résultante a ensuite été employée pour reconstruire 2.545 profils relatifs d’abondance de protéine. Comme le montre la figure 2D, plus de 75 % de ces profils protéiques étaient basés sur au moins trois peptides indépendants spécifiques aux protéines. Ensuite, le protocole a évalué la pertinence de la taille progressive de l’échantillonnage du gel BN-PAGE pour la résolution des complexes protéiques. À cette fin, les ensembles de données de tranches ont été rejoints en résumant les informations PV de deux, trois ou quatre tranches consécutives, simulant ainsi le résultat pour des tailles d’étape de 0,5 mm, 0,75 mm et 1 mm (par rapport à l’échantillonnage initial de 0,25 mm). La figure 3 illustre les profils d’abondance résultants pour la protéine TPC1 à titre d’exemple (A-D). À 0,25 mm, les intensités relatives et la séparation de la taille des populations complexes associées au TPC1(figure 3A) étaient bien en accord avec les résultats de l’analyse de la tache occidentale(figure 1B, panneau supérieur); bien que, le profil a montré un certain bruit, la plupart du temps résultant de valeurs manquantes (“lacunes”) dans la matrice PV utilisée pour la quantification. L’assemblage de deux tranches correspondant à 0,5 mm a maintenu les intensités et la séparation correctes des complexes associés à TPC1 et a enlevé le bruit de la quantité(figure 3B). En revanche, des pas plus grands de 0,75 mm et 1 mm (figure 3C,D) ont entraîné une perte de résolution de la taille et aboli la discrimination des sous-populations complexes de TPC1. Il convient de noter que la grande majorité des analyses conventionnelles publiées BN-MS utilisent des tranches de 2 mm coupées manuellement (environ 60 pour couvrir l’ensemble de la voie de gel)7,8,9,10. La conversion de la distance de migration ou de l’indice de tranche en taille moléculaire est généralement basée sur des marqueurs, soit des protéines standard indigènes disponibles dans le commerce, soit des complexes protéiques endogènes bien caractérisés avec une composition sous-unité connue (principalement [super] complexes de la chaîne respiratoire oxydative mitochondriale [OXPHOS])13. Cependant, puisque la séparation BN-PAGE est basée sur la section moléculaire efficace qui est déterminée non seulement par la masse moléculaire mais aussi par la structure 3D et le nombre de lipides, de détergents et de molécules de Coomassie associés, les protéines individuelles peuvent montrer déviations plus importantes. Par conséquent, il a été choisi d’utiliser de plus grands ensembles de complexes protéiques comme marqueurs11. L’intrigue de la figure 4 montre 23 marqueurs sélectionnés avec une sous-unité représentative montrée sous forme de cercle noir, indiquant les valeurs log10 de sa masse moléculaire prévue (selon la base de données UniProtKB/Swiss-Prot) vs. l’indice de tranche du maximum de pic de profil correspondant. Ces derniers ont été obtenus à partir d’ajustements gaussiens automatisés aux données d’abondance relative, comme le montre l’en-tête de la figure 4 montrant l’exemple avec le chaperon BCS1. La régression linéaire (ligne rouge) a fourni une fonction pour convertir les valeurs d’index de tranche en tailles moléculaires apparentes, qui se sont étendues de 160-630 kDa, le long de la section étudiée de gel. Enfin, l’analyse a fourni de l’information sur des complexes bien caractérisés et a démontré l’existence de nouvelles sous-unités et d’assemblages complexes. Des exemples mettant en évidence différents aspects du complexe sont présentés à la figure 5 (A-C : protéines exprimées ou de préférence situées dans des compartiments endosomal; D-F : complexes d’autres localisations subcellulaires). La ferritine de transport de fer est connue pour former des complexes à partir de 24 sous-unités légères (FRIL1) et/ou lourdes (FRIH), avec un poids moléculaire total de 440 kDa14 (figure 5A, flèche remplie). Les profils de sous-unité (figure 5A) suggèrent l’existence d’au moins deux formes plus petites du complexe (avec une masse apparente de 360 kDa et 340 kDa; flèches ouvertes) avec des stoichiométries distinctes à chaîne lourde/légère (mieux visibles après la mise à l’échelle de abondantes, enset de la figure 5A) qui sont abondamment présents dans les endosomes. En revanche, les complexes nicalin-nomo115 (figure 5D), le complexe de noyau gamma-sécrétase16 (figure 5B), et la machinerie GPI-transamidase17 (figure 5E) montrent les rapports d’abondance de leurs sous-unités de noyau sur toute la gamme de taille et indépendants de l’association avec des protéines additionnelles. Cela indique que leurs sous-unités sont exclusives les unes aux autres. Les vacuolar H-ATPasessont des complexes multiprotéinés assemblés à partir d’un pool de plus de 20 sous-unités de manière modulaire d’un poids moléculaire total d’environ 900 kDa. La figure 5C révèle des sous-complexes dont les compositions distinctes proviennent d’au moins 17 sous-unités, représentant des intermédiaires biologiques ou des sous-complexes générés par les conditions expérimentales, dont certains ont également été observée dans une étude récente du BN-MS18. Un autre exemple complexe multi-protéines est le protéasome19 (Figure 5F). L’inspection minutieuse des profils d’abondance des sous-unités alpha et bêta formant le noyau protéasome 20S suggère deux populations complexes majeures avec des différences subtiles de taille (590 kDa et 575 kDa, indiquées par des flèches grises) et l’intégration de trois bêta-unités. En résumé, le profilage complexe csBN-MS des membranes rénales enrichies d’endosome fournit des résultats complets et détaillés concernant l’intégration (i) de protéines cibles uniformes et peu abondantes dans des complexes, (ii) la composition générale des sous-unit complexes et stoichiométrie, et (iii) hétérogénéités complexes, sous-structures, et (dis)assemblage intermédiaires. Figure 1 : Séparation préparative de BN-PAGE des membranes endosome-enrichies solubilized du rein de souris utilisant le canal intracellulaire TPC1 comme marqueur. (A) Localisation immunohistochimique de la protéine TPC1 dans les tubules proximales rénaux par microscopie confocale. Vert : anticorps anti-TPC112 colorations visualisées avec l’IgG anti-lapin de chèvre cy3-biotinylated secondaire ; rouge : lectine de tétragonolobus de Lotus biotinylated (LTL, 10 g/mL, FITC-conjugué) marquant la surface luminale des cellules tubuleuses proximales. L’enset montre la coloration d’une section correspondante d’un rein TPC1-KO comme un contrôle négatif. Les barres d’échelle blanche sont de 20 m. A noter également une forte expression TPC1 dans les vésicules intracellulaires, connu à partir d’expériences indépendantes pour représenter les endosomes précoces et de recyclage12. (B) Séparation préparative BN-PAGE de 2,5 mg de membranes enrichies d’endosome solubilized sur un gel de gradient de polyacrylamide de 1%-13% (w/v). Une voie étroite (encadrée en rouge) a été coupée pour l’analyse ultérieure de sDS-PAGE/western blot (panneau supérieur), résolvant différents complexes tPC1-associés et modèles de glycosylation (flèches rouges : anti-TPC1/anti-lapin HRP/ECL; vert : positions et modèles prévus masses [MDa] des complexes protéiques marqueurs identifiés par la coloration totale des protéines [tache de tache de rubis SYPRO]) de la tache. De droite à gauche : Na/K-transportATPase, Dimer complexe Cytochrome b-c1, synthase ATP, NADH:ubiquinone oxidoreductase. Une section d’intérêt de 3 cm de la voie de gel a été excisée, incorporée dans le milieu d’intégration de tissu, montée, et découpée en 101 sections (0.25 mm) le long du front de migration de protéine utilisant un cryomicrotome (panneau inférieur ; voir lien vidéo). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Paramètres clés déterminant l’exactitude de l’affectation et de la quantification du signal de SP ainsi que la profondeur de l’analyse. (A) Répartition des erreurs de masse relative (en ppm) après l’étalonnage m/z de La SP/MS séquencées (barres rouges) et indirectement assignées (c.-à-d. en fonction des temps de masse et de rétention étroitement appariés, voir protocole; barres bleues) signaux peptidiques. Cela suggère une erreur de masse finale de 1 ppm (pour 95 % des signaux/PV assignés) et un taux très faible de fausses affectations positives. (B) Répartition des écarts de temps de rétention nano-HPLC par rapport à la moyenne totale après l’alignement du temps d’élution des signaux peptidiques, à l’aide de la régression de Loess (voir protocole) et du codage des couleurs tel qu’il est utilisé dans (A). L’erreur de temps est inférieure à 30 s pour les signaux peptidiques/PVs assignés. (C) Variation run-to-run des intensités totales de SP tracées par rapport à la moyenne des deux échantillons voisins. Ces facteurs d’échelle ont été appliqués aux tables PV brutes pour minimiser les erreurs techniques systématiques. (D) Informations peptides utilisées pour calculer les profils d’abondance relative des protéines. Après avoir filtré des peptides spécifiques aux protéines pour les valeurs aberrantes, les identifications ponctuelles ou uniques (voir protocole), 2 545 profils d’abondance de protéines ont été déterminés, dont 75 % étaient basés sur au moins trois peptides en toute confiance raisonnable. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Impact critique de la taille de l’étape dans l’échantillonnage du gel sur la résolution du complexome de TPC1. Les ensembles de données ont été rejoints en résumant les intensités de signal dans les groupes de 1, 2, 3 et 4 tranches consécutives (A-D, respectivement) et traités de façon identique pour simuler différentes tailles d’étapes dans le découpage de gel comme indiqué. Le profil TPC1 montre un certain bruit (suréchantillonnage) à 0,25 mm, mais une bonne résolution de taille de trois populations complexes (voir aussi Figure 1B), qui est en grande partie préservée à une largeur d’étape de 0,5 mm. La discrimination de ces populations se perd à mesure que 1 mm est approché. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Détermination du poids moléculaire apparent. 23 complexes de marqueurs avec composition moléculaire définie (tel qu’indiqué, selon UniProtKB/Swiss-Prot) ont été utilisés comme marqueurs de taille. Les valeurs logarithmiques de leur poids moléculaire prévu (en kDa) ont été tracées vs. l’indice de tranche maximale de pic de profil de la sous-unité de protéine représentative indiquée (cercles remplis en noir). L’ajustement linéaire de régression à cette donnée (ligne rouge) a fourni une fonction convertissant des valeurs d’index de tranche aux poids moléculaires apparents. Les maxima de crête ont été déterminés par des ajustements gaussiens automatisés aux pics de profil de protéine comme indiqué dans l’enset (droite) pour la protéine de chaperon BCS1 (données primaires en bleu, limites d’ajustement indiquées par les lignes oranges, fonction d’ajustement en rouge). En outre, ces ajustements détermines pic demi-maximum largeurs (ligne verte, 6,5 tranches, ou 1,6 mm pour l’exemple montré) avec les complexes de mise au point les plus pointus couvrant autour d’un gel de 1,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : Exemples de profils de sous-unité complexes protéiques. Abondance relative de protéines vs. poids moléculaire apparent tracé pour la chaîne lourde et légère de la ferritine (A) révélant l’hétérogénéité moléculaire de la stoichiométrie subunit de ferritine, plus clairement visible après la redimensionnement des abondances (enset). Les flèches remplies et les flèches ouvertes désignent le complexe complet (440 kDa) et deux sous-complexes, respectivement. Les sous-unités gamma-sécrétase (B) se sont quantitativement intégrées dans une population complexe unifamiliale. Les sous-complexes de vacuolar H-ATPases(C) présentaient de multiples assemblages avec une composition sous-unité distincte, tous exprimés en endosomes. Les protéines nomo1 et nicalin (D) ont formé un complexe exclusif (le GPI-transamidase), qui est une machinerie enzymatique multi-subunit formant plusieurs complexes. (E) Le complexe de noyau protéasome 20S montrant (F) un modèle subtil de sous-complexe avec deux populations indiquées par des flèches en gris, toutes provenant d’autres localisations subcellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

L’étude présentée s’est construite sur la technique csBN-MS précédemment comparée à une préparation mitochondriale11 et a incorporé des améliorations dans la préparation d’échantillon, le traitement de gel, et l’évaluation de données de SP. L’analyse ciblée d’une section du gel BN-PAGE de séparation à grande échelle a fourni un ensemble complet de données montrant des mesures de qualité comparables à l’étude avec des membranes mitochondriales. Les erreurs de temps de masse et de rétention ainsi que les variations de courant à fonctionnement ont été maintenues très faibles et ont fourni la base pour déterminer les profils fiables d’abondance de protéine. La résolution de la taille semblait bonne, avec des largeurs de pointe demi-maximales aussi basses que six tranches (correspondant à 1,5 mm, figure 4) et des différences de taille relatives inférieures à 10 % résolues (Figure 3, Figure 5A). Ces valeurs ne répondaient pas entièrement à la qualité de résolution de la taille de l’analyse csBN-MS précédente des mitochondries (malgré la taille plus petite de l’étape d’échantillonnage de gel choisie), mais elles sont nettement meilleures que les performances du BN-MS conventionnel ou de la SP d’exclusion de taille approche20 qui sont récemment devenus populaires.

L’importance d’une résolution de taille complexe efficace est soulignée par l’expérience de simulation de la figure 3 (à l’aide des complexes associés au TPC1) qui peut difficilement être résolue par l’analyse de la tache occidentale 2D BN/SDS-PAGE ( Figure1B). Ces résultats suggèrent que le tranchage de 0,25 mm dans ce cas a entraîné un certain suréchantillonnage, mais il s’est avéré tout de même utile pour l’élimination du « bruit de quantification » sans compromettre la résolution efficace de la taille. Ainsi, conformément aux résultats précédents11, une taille d’étape d’échantillonnage de 0,3 mm est généralement recommandable.

Notamment, la discrimination des complexes associés à TPC1 est complètement perdue avec l’échantillonnage de gel de 1 mm, qui est la plus petite taille d’étape fournie par le découpage manuel dans le BN-MS5conventionnel,6. Cela peut expliquer le fait que, malgré les puissantes technologies de sP disponibles, très peu de complexes protéiques et de sous-unités ont été identifiés par le profilage complexome. Outre sa bonne puissance de résolution, csBN-MS offre une grande polyvalence. Les complexes membranaires et les complexes protéiques solubles allant de 50 kDa à plusieurs MDa peuvent être résolus efficacement dans une seule expérience avec un biais minimum11. Cela contraste avec les techniques de séparation alternatives utilisées pour le profilage complexome comme l’exclusion de taille ou la chromatographie d’échange d’ions, qui fonctionnent avec des sous-ensembles de protéines solubles avec certaines gammes de taille ou des propriétés de charge. En revanche, le csBN-MS est moins évolutif (charge maximale de 3 mg de protéines par gel), peut être techniquement difficile et ne peut pas être automatisé.

Dans l’ensemble, les résultats démontrent que le profilage du complexome basé sur le csBN-MS peut être appliqué avec succès à des cibles non mitochondriales, mais indique également certains défis associés. Ainsi, l’extraction efficace et la stabilité biochimique des complexes protéiques nécessitent plus d’optimisation, et les étapes de nettoyage et peuvent encore être limitées. Dans la fenêtre de taille étudiée, le nombre de complexes protéiques bien ciblés et monodispersés était en effet considérablement plus faible (données non montrées) par rapport à un échantillon mitochondrial. Il est également recommandé d’abaisser les charges d’échantillon BN-PAGE pour obtenir une séparation acceptable du gel. Des charges plus élevées peuvent nécessiter des voies de gel plus larges qui sont plus difficiles à traiter correctement pour le découpage (voir la vidéo d’accompagnement). En outre, la complexité des protéines des échantillons était plus élevée (environ deux fois) que les digestes de tranches dérivées des mitochondries, ce qui a conduit à plus de valeurs PV manquantes et une plage dynamique réduite. En fait, certaines petites protéines qui devraient faire partie des complexes présentés à la figure 5 manquaient dans les analyses. Ces problèmes peuvent être résolus à l’avenir en utilisant des instruments de SP plus rapides et plus sensibles ou des modes d’acquisition indépendants des données.

La préparation de l’échantillon est très critique pour la récupération complexe de protéines, la stabilité et la qualité de séparation du gel. Les paramètres et les procédures doivent être optimisés pour chaque tissu source, lysate cellulaire, membrane (fraction) et complexe protéique d’intérêt. Les recommandations générales suivantes sont fournies qui peuvent aider à étendre les applications de csBN-MS :

(i) Préparation d’échantillons frais et éviter le réchauffement/congélation, fortes dilutions, changements dans les conditions tampons et retards inutiles;

(ii) Utilisation de tampons essentiellement dépourvus de sels (remplacer par une bêtaine ou un acide aminocaproïque de 500 à 750 mM), environ un pH neutre et contenir jusqu’à 1 % (w/v) de détergent non dénaturant (rapport protéine/détergent entre 1:4-1:10 pour la solubilité de la membrane complexes protéiques, aucun détergent requis pour les complexes protéiques solubles);

(iii) Des essais et un ajustement minutieux des conditions détergentes par l’analyse BN-PAGE, car ceux-ci peuvent avoir un impact important sur l’efficacité de la solubilité complexe, de la représentation des complexes protéiques membranaires dans l’échantillon, de la stabilité et de l’homogénéité des micelles détergentes. Ces dernières sont des conditions préalables pour que les protéines se concentrent en bandes distinctes/populations complexes sur les gels BN-PAGE. La littérature précédente offre un large éventail de détergents neutres. Cependant, DDM (n-dodecyl -d-maltoside)1,2,4,5,6 et la numérisation3,5,7,8, 9,10,13,18 ont été les choix les plus populaires pour les analyses BN-MS à ce jour. Il faut souligner que toute condition détergente représente nécessairement un compromis entre l’efficacité de la solubilité et la préservation des interactions protéiques et peut ne pas être également adaptée à tous les types de protéines cibles et de matériel source;

(iv) Enlever les polymères chargés comme les fibrilles, les filaments, la polylysine, l’ADN et les composants abondants de poids moléculaire inférieur (c.-à-d. les métabolites, les lipides ou les peptides). Ceci peut être accompli par ultracentrifugation, filtration de gel, ou dialyse. Ceci est particulièrement important pour les lysates totaux de cellules ou de tissu ;

(v) Ajout de Coomassie G-250 (concentration finale 0,05%-0,1%) et le saccharose (pour augmenter la densité pour le chargement, la concentration finale de 10 %-20 % [w/v]) à l’échantillon juste avant le chargement, pour effacer par ultracentrifugation courte, charger l’échantillon sans perturbation, et commencer la course immédiatement après.

À l’avenir, le profilage complexome basé sur le csBN-MS offre des options pour le multiplexage afin d’étudier la dynamique complexe protéique ou les changements liés à des conditions biologiques spécifiques. La séparation combinée des échantillons étiquetés métaboliquement tel que proposé pour le profilage basé sur l’exclusion de taille21 semble simple, mais elle peut être entravée par l’échange spontané de sous-unité dans des complexes se produisant indépendamment de la séparation utilisée méthode. Alternativement, les échantillons étiquetés peuvent être résolus dans les voies de gel voisines, qui peuvent ensuite être co-tranchées ou combinées post-digestion pour l’analyse différentielle avec une sensibilité et une robustesse élevées.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – Projet ID 40322702 – SFB 1381 et dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne CIBSS – EXC-2189 – Project ID 390939984. Nous remercions Katja Zappe pour son assistance technique.

Materials

30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio Rad #1610158 Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13%
30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 Bio Rad #1610154 Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13%
SYPRO Ruby Protein Blot Stain Bio Rad #1703127 Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection
Coomassie Brilliant Blue G-250 Serva no. 35050 Centrifugate stock solutions prior to use
ComplexioLyte 47 Logopharm CL-47-01 Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins
Embedding Medium / Tissue Freezing Medium Leica Biosystems 14020108926 Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome
Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm Merck IPVH00010
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent GE Healthcare RPN2232
Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml n.a. n.a. any supplier, important for making gel section embedding tool
broad razor blade n.a. n.a. any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes
metal tube / cylinder, ca. 4 cm long n.a. n.a. mold for embedding and freezing of gel samples
Protein LoBind Tubes, 1.5 ml Eppendorf Nr. 0030108116 highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption
sequencing-grade modified trypsin Promega V5111
C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm Dionex / Thermo Scientific P/N 160454
PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm) New Objective FS360-75-8
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm) Dr. Maisch GmbH r13.93. columns packed manually
rabbit anti-TPC1 antibody Gramsch Laboratories custom production described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboratories CY-1300 described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated Vector Laboratories #B1325 described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
cryo-microtome Leica CM1950 Leica Biosystems 14047743905
Mini Protean II Cell with wetblot unit Bio Rad n.a. for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more)
Penguin Midi Gel Electrophoresis System PeqLab n.a. for BN-PAGE (not sold any more)
Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera Zeiss / Photometrics n.a.
peristaltic pump (IP high precision multichannel) Ismatec ISM940 for casting of gradient polyacrylamide gels
gradient mixer with stirring (two chambers) selfmade, alternatively Bio Rad 1652000 or 1652001 for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)
ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor Sorvall / Thermo Scientific n.a. for sample preparation (not sold any more)
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC Dionex / Thermo Scientific ULTIM3000RSLCNANO
Orbitrap Elite mass spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMAZQ

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Müller, C. S., Bildl, W., Klugbauer, N., Haupt, A., Fakler, B., Schulte, U. High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis. J. Vis. Exp. (152), e60096, doi:10.3791/60096 (2019).

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