التنميط العالي الاستبانة بواسطة Cryoslicing BN-MS التحليل
Summary
يتم تقديم البروتوكول متعدد الاستخدامات الذي يستخدم ميكروتومي لتحديد السمات المعقدة عاليه الدقة.
Abstract
البروتينات عموما ممارسه الوظائف البيولوجية من خلال التفاعلات مع البروتينات الأخرى, اما في الجمعيات البروتين الحيوي أو كجزء من المجمعات التي شكلت باقتدار. ويمكن حل هذه الاخيره باناقه وفقا للحجم الجزيئي باستخدام الأصلي بولياكرياميد هلام الكهربائي (BN الصفحة). وقد ثبت جيدا اقتران هذه الحالات بالطيف الكتلي الحساس ويسمح نظريا باجراء تقييم شامل للمعقد القابل للاستخراج في العينات البيولوجية. بيد ان هذا النهج شاق إلى حد ما ويوفر قدرا محدودا من الدقة المعقدة والحساسية. أيضا ، وقد ظل تطبيقه يقتصر علي وفره البروتينات الميتوكوندريا والبلازما. التالي ، بالنسبة لغالبيه البروتينات ، لا تزال هناك نقص في المعلومات المتعلقة بالاندماج في مجمعات البروتين المستقرة. العرض هنا هو نهج الأمثل لتنميط المعقدة التي تتالف من الفصل الاعداديه BN-الصفحة ، والعينات الفرعية ملليمتر من الممرات هلام واسعه من قبل تقطيع بالتبريد ، وتحليل الطيف الشامل مع كميه البروتين خاليه من التسمية. يتم وصف الإجراءات والاداات اللازمة للخطوات الهامه بالتفصيل. وكتطبيق ، يصف التقرير التحليل المعقد لجزء من غشاء التنظير الداخلي المخصب المذاب من الكلي الفاره ، مع 2,545 البروتينات في المجموع. وتبين النتائج تحديد البروتينات الغشائية الموحدة والمنخفضة الوفرة مثل القناات الايونيه داخل الخلايا بالاضافه إلى الدقة العالية ، وأنماط تجميع البروتين المعقدة ، بما في ذلك ايزوفورم غليكويليشن. وتتفق النتائج مع التحاليل الكيميائية الحيوية المستقلة. وباختصار ، تسمح هذه المنهجية لتحديد شامله وغير متحيزة من البروتين (سوبر) المجمعات وتكوينها الوحدة الفرعية ، وتوفير أساس للتحقيق في القياس ، والتجمع ، وديناميكيات التفاعل من المجمعات البروتينية في اي النظام البيولوجي.
Introduction
وقد اقترن فصل الصفحات الاولي بالتحليل المباشر لل LC-MS بواسطةالمجموعتين البحثيتين majeran1 و wessels 2 باستخدام التقطيع اليدوي لممرات جل الصفحات bn. وقد حددت تحاليلهم عددا من مجمعات البروتينات الغشائية الوفيرة المعروفة بتكوين الوحدة الفرعية من البلازما النباتية والميتوكوندريا الخلوية ، علي التوالي. ومع ذلك ، فان هذه التحليلات ابعد ما تكون عن الشمول ولا تسمح بالتحديد غير المتحيز للجمعيات الجديدة. ومنذ ذلك الحين ، تحسن أداء مقاييس الطيف الجماهيري وأساليب القياس الكمي الخالية من العلامات إلى حد كبير ، مما مكن من اجراء تحليلات شامله لهذه المقاييس. وقد صاغ هذا مصطلح “التنميط المعقد”. علي سبيل المثال, وحللت هايد وزملاءه الفئران الميتوكوندريا القلب تحديد وتجميع 464 البروتينات الميتوكوندريا, مما يؤكد العديد من الجمعيات المعروفة. الاضافه إلى ذلك ، وجدوا TMEM126B ان تكون الوحدة الفرعية الجديدة والحاسمة لمجمع التجميع المحدد3. وقد تم الحصول علي نتائج مماثله (مع ملفات تعريف البروتين الميتوكوندريا 437) في دراسة موازيه من الخلية يشيك الميتوكوندريا4.
وعلي الرغم من هذه التحسينات ، فقد ظلت هناك عده قضايا تحد من الإمكانات الكاملة لهذه المجموعة من أجل التنميط المعقد. ومن القيود الرئيسية هو دقه حجم المجمعات التي يتم تحديدها من قبل عاملين: (1) نوعيه الفصل BN-PAGE ، والذي يعتمد علي التوحيد من التدرج المسام هلام مصفوفة ، فضلا عن استقرار/الذوبان في المجمعات عينه ، و (2) حجم الخطوة من أخذ العينات هلام ، وهو في أفضل 1 ملم عند استخدام اليدوية التقليدية تشريح5،6. ضعف القرار الحجم لا يخطئ فقط المعقدة المتشابكة والتغاير ، ولكنه يؤثر سلبا أيضا علي المدى الديناميكي والثقة من التخصيص غير متحيزة ، والوحدة الفرعية من نوفو والتقدير الكمي.
وتشمل التحديات الأخرى دقه القياس الكمي للبروتين وتغطيه المجموعة الدينامية الفعلية لوفره البروتينية في العينة عن طريق تحليل الطيف الكتلي. ولذلك ، فقد ظل تطبيق التنميط المعقد لل BN-MS مقتصرا إلى حد كبير علي العينات البيولوجية ذات التعقيد الأقل ، والتعبير العالي عن المجمعات المستهدفة ، وخصائص الاذابه المواتية (اي البلازما ، الميتوكوندريا ، الكائنات المجهرية)6،7،8،9،10.
وقد أدخلنا مؤخرا بمساعده التشريح الدقيق لل BN-MS (csBN-MS) ، والذي يجمع بين العينات الدقيقة الفرعية من الممرات الهلامية من BN-PAGE مع تحليل MS الشامل ومعالجه بيانات MS المفصلة لتحديد ملامح البروتين مع ارتفاع الثقة11. التطبيق علي اعداد غشاء الميتوكوندريا من أدمغه الفئران أظهرت سابقا غير الملبية القرار الفعال المعقدة الحجم والتغطية القصوى لسلسله الجهاز التنفسي المؤكسد (OXPHOS) الوحدات الفرعية (اي ، 90 من 90 MS الوصول اليها). وقد حدد هذا المثال أيضا عددا من الجمعيات البروتينية الجديدة.
وصفت هنا الإجراءات الأمثل للجدول المعد الفصل BN-PAGE من المجمعات البروتينية (لا تقتصر علي مصدر بيولوجي معين) ، والصب من الهلام اعداد كبير من الصفحات BN ، التقطيع بالتبريد من الممرات هلام واسعه ، وبيانات MS معالجه. ويظهر أداء التنميط عاليه الدقة لاعداد معقده البروتين من الاغشيه الكلي الفئران المخصب التنظير. وأخيرا ، تناقش الفوائد الناجمة عن زيادة الاستبانة والدقة في تحديد الكميات الطيفية الشاملة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الدراسة المقدمة التي بنيت علي تقنيه csBN-MS قياسها سابقا مع اعداد الميتوكوندريا11 ودمج التحسينات في اعداد العينة ، ومعالجه هلام ، وتقييم البيانات MS. وقدم التحليل المركز لقسم من هلام الفصل واسعه النطاق BN-PAGE مجموعه شامله من البيانات التي تبين تدابير الجودة مماثله للدراسة مع اغشيه الميتوكوندريا. وظلت الأخطاء التي طرات علي الكتلة ووقت الاستبقاء ، فضلا عن الاختلافات في التشغيل ، منخفضه جدا ووفرت الأساس لتحديد ملامح موثوقه لوفره البروتين. حجم القرار يبدو ان تكون جيده ، مع عرض الذروة نصف القصوى منخفضه مثل سته شرائح (المقابلة 1.5 مم ، الشكل 4) والاختلافات النسبية حجم اقل من 10 ٪ حل (الشكل 3، الشكل 5ا). هذه القيم لم تلبي تماما جوده دقه الحجم من تحليل csBN-MS السابقة من الميتوكوندريا (علي الرغم من أصغر حجم الخطوة أخذ العينات هلام المختار) ، لكنها أفضل بكثير من أداء التقليدية BN-MS أو حجم الاستبعاد MS تقترب من20 التي أصبحت في الاونه الاخيره شعبيه.
وتبرز اهميه دقه الحجم المعقدة العالية الفعالية في تجربه المحاكاة في الشكل 3 (باستخدام المجمعات المرتبطة بالTPC1) التي يصعب حلها بواسطة تحليل اللطخه الغربية من الدرجة الثانية (الشكل 1ب). وتشير هذه النتائج إلى ان تشريح 0.25 مم في هذه الحالة ادي إلى بعض الإفراط في أخذ العينات ، ولكن هذا ثبت انه لا يزال مفيدا للقضاء علي “التشويش الكمي” دون المساومة علي دقه الحجم الفعال. التالي ، تمشيا مع النتائج السابقة11، حجم خطوه أخذ العينات من ~ 0.3 مم هو عموما الموصي بها.
ولا سيما ان التمييز في المجمعات المرتبطة بالTPC1 يفقد تماما مع أخذ عينات هلام 1 مم ، وهو أصغر حجم الخطوة المقدمة من التقطيع اليدوي في التقليدية BN-MS5،6. وهذا قد يفسر حقيقة انه علي الرغم من التكنولوجيات MS قويه المتاحة, وقد تم تحديد عدد قليل جدا من مجمعات البروتين والوحدات الفرعية من قبل التنميط المعقدة. بالاضافه إلى قوه حل جيده ، csBN-MS يقدم براعة عاليه. يمكن حل المجمعات المرتبطة بغشاء ومجمعات البروتين القابلة للذوبان التي تتراوح من 50 كده إلى عده MDa بشكل فعال في تجربه واحده مع الحد الأدنى من التحيز11. هذا يتناقض مع تقنيات الفصل البديلة المستخدمة لتنميط المعقدة مثل حجم الاستبعاد أو اللوني تبادل الأيونات ، التي تعمل مع مجموعات من البروتينات القابلة للذوبان مع نطاقات معينه من حجم أو تهمه خصائص. علي الجانب السلبي ، csBN-MS اقل قابليه للتطوير (الحمولة القصوى من ~ 3 ملغ بروتين لكل هلام) ، قد تكون صعبه من الناحية الفنية ، ولا يمكن ان تكون تلقائية.
وإجمالا ، تبين النتائج ان التنميط المعقد القائم علي csBN MS يمكن تطبيقه بنجاح علي الأهداف غير المتقدريه ولكنه يشير أيضا إلى بعض التحديات المرتبطة به. التالي ، يتطلب الاستخراج الفعال والاستقرار البيوكيميائي لمجمعات البروتين المزيد من التحسين ، وخطوات التنظيف وقد لا تزال محدوده. وفي اطار حجم التحقيق ، كان عدد المجمعات البروتينية المركزة بشكل جيد ، والمكونات أحاديه التشتت ، في الواقع اقل بكثير (لم تظهر البيانات) بالمقارنة مع عينه من الميتوكوندريا. ويوصي أيضا لخفض الأحمال العينة BN-PAGE للحصول علي انفصال هلام مقبوله. قد تتطلب الأحمال العالية ممرات جل أوسع أكثر صعوبة لمعالجتها بشكل صحيح لتقطيعها (انظر الفيديو المصاحب). وعلاوة علي ذلك ، كان تعقيد البروتين من العينات اعلي (حوالي ضعفين) من الهضم شريحة المشتقة من الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى المزيد من القيم الكهروضوئية المفقودة والنطاق الديناميكي المنخفض. في الواقع ، بعض البروتينات الصغيرة المتوقع ان تكون جزءا من المجمعات المبينة في الشكل 5 كانت مفقوده في التحليلات. ويمكن حل هذه المشاكل في المستقبل باستخدام أدوات MS أسرع وأكثر حساسية أو أوضاع اكتساب مستقله للبيانات.
اعداد العينة أمر بالغ الاهميه لاستخلاص البروتين المعقدة ، والاستقرار ، ونوعيه الانفصال هلام. يجب ان تكون المعلمات والإجراءات الأمثل لكل مصدر الانسجه ، الخلية lysate ، غشاء (كسر) ، والبروتين المعقدة من الفائدة. وترد التوصيات العامة التالية التي قد تساعد علي توسيع نطاق تطبيقات csBN-MS:
‘ 1 ‘ اعداد عينات جديده وتجنب الاحترار/التجميد ، والتخفيفات القوية ، والتغيرات في الظروف العازلة ، والتاخيرات غير الضرورية ؛
‘ 2 ‘ استخدام المخازن المؤقتة الخالية أساسا من الأملاح (يستعاض عنها بالبيتين 500-750 مم أو بحمض امينوكابرويك) ، وعن درجه الحموضة المحايدة ، وتحتوي علي ما يصل إلى 1 في المائة (ث/ف) من المنظفات غير المزيلة (البروتين: نسبه المنظفات بين 1:4-1:10 لأذابه الغشاء مجمعات البروتين ، لا المنظفات اللازمة لمركبات البروتين القابلة للذوبان) ؛
‘ 3 ‘ الاختبار الدقيق وضبط ظروف المنظفات بواسطة الصفحة التحليلية BN ، لأنها قد تؤثر بشده علي كفاءه الذوبان المعقد ، وتمثيل مجمعات البروتين الغشائي في العينة ، والاستقرار ، وتجانس البروتين المنظفات micelles. هذه الاخيره هي الشروط المسبقة للبروتينات للتركيز كفرق متميزة/المجموعات السكانية المعقدة علي الهلام BN-PAGE. الأدب السابق يقدم مجموعه واسعه من المنظفات المحايدة. ومع ذلك ، DDM (ن-دوديسيل β-د-مالتوسيدي)1،2،4،5،6 و ديجيتونين3،5،7،8، 9,10,13,18 وكانت الخيارات الأكثر شعبيه لتحليلات BN-MS حتى الآن. ويجب التاكيد علي ان اي حاله من حالات المنظفات تمثل بالضرورة حلا توفيقيا بين كفاءه الذوبان والحفاظ علي تفاعلات البروتين وقد لا تكون مناسبه بالتساوي لجميع أنواع البروتين المستهدف والمواد المصدرية ؛
‘ 4 ‘ أزاله البوليمرات المشحونة مثل ألياف الليفية ، والخيوط ، وبوليلسين ، والحمض النووي ، ومكونات الوزن الجزيئي المنخفضة الوفيرة (اي نواتج الأيض أو الدهون أو الببتيدات). ويمكن تحقيق ذلك عن طريق التسميد ، والترشيح هلام ، أو غسيل الكلي. وهذا مهم بشكل خاص لمجموع الخلايا أو الانسجه lysates;
‘ 5 ‘ أضافه كوماسي G-250 (التركيز النهائي 0.05%-0.1%) والسكروز (لزيادة الكثافة للتحميل ، والتركيز النهائي 10 ٪-20 ٪ [ث/ف]) إلى العينة قبل التحميل فقط ، لمسح بواسطة ultracentrifugation قصيرة ، وتحميل العينة دون اضطراب ، وبدء تشغيل مباشره بعد ذلك.
وكمنظور مستقبلي ، يقدم التنميط القائم علي csBN MS خيارات لمضاعفه الإرسال لدراسة ديناميات معقده البروتين أو التغييرات المتعلقة بالظروف البيولوجية المحددة. ويبدو الفصل المشترك بين العينات الموسومة بالأيض علي النحو المقترح لتحديد الحجم القائم علي الاستبعاد21 واضحا ، ولكنه قد يعوقه تبادل الوحدات الفرعية العفوية في مجمعات تحدث بشكل مستقل عن الانفصال المستخدم الاسلوب. بدلا من ذلك ، يمكن حل العينات الموسومة في الممرات هلام المجاورة ، والتي يمكن بعد ذلك ان تكون مشتركه في شرائح أو مجتمعه بعد هضم للتحليل التفاضلي مع حساسية عاليه ومتانة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ساندت هذا دراسة كان ب ال [ديوتسكه] [فورسكهنغجميندسكهفت] ([دغ], المانيه بحث مؤسسه)-[بروجكت-معرف] 403222702-[سفيس] 1381 وتحت ألمانيا امتياز استراتيجية [كسبس-اكسك-2189-مشروع [فيد] 390939984. نشكر كاتيا زابي علي المساعدة الفنية.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio Rad | #1610158 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13% |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio Rad | #1610154 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13% |
| SYPRO Ruby Protein Blot Stain | Bio Rad | #1703127 | Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Serva | no. 35050 | Centrifugate stock solutions prior to use |
| ComplexioLyte 47 | Logopharm | CL-47-01 | Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins |
| Embedding Medium / Tissue Freezing Medium | Leica Biosystems | 14020108926 | Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome |
| Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm | Merck | IPVH00010 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml | n.a. | n.a. | any supplier, important for making gel section embedding tool |
| broad razor blade | n.a. | n.a. | any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes |
| metal tube / cylinder, ca. 4 cm long | n.a. | n.a. | mold for embedding and freezing of gel samples |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | Nr. 0030108116 | highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption |
| sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm | Dionex / Thermo Scientific | P/N 160454 | |
| PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm) | New Objective | FS360-75-8 | |
| ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm) | Dr. Maisch GmbH | r13.93. | columns packed manually |
| rabbit anti-TPC1 antibody | Gramsch Laboratories | custom production | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
| Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | CY-1300 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
| biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated | Vector Laboratories | #B1325 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
| cryo-microtome Leica CM1950 | Leica Biosystems | 14047743905 | |
| Mini Protean II Cell with wetblot unit | Bio Rad | n.a. | for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more) |
| Penguin Midi Gel Electrophoresis System | PeqLab | n.a. | for BN-PAGE (not sold any more) |
| Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera | Zeiss / Photometrics | n.a. | |
| peristaltic pump (IP high precision multichannel) | Ismatec | ISM940 | for casting of gradient polyacrylamide gels |
| gradient mixer with stirring (two chambers) | selfmade, alternatively Bio Rad | 1652000 or 1652001 | for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf) |
| ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor | Sorvall / Thermo Scientific | n.a. | for sample preparation (not sold any more) |
| UltiMate 3000 RSLCnano HPLC | Dionex / Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMAZQ |
References
- Majeran, W., et al. Consequences of C4 Differentiation for Chloroplast Membrane Proteomes in Maize Mesophyll and Bundle Sheath Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 7, 1609-1638 (2008).
- Wessels, H. J., et al. LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes. Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).
- Heide, H., et al. Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex. Cell Metabolism. 16 (4), 538-549 (2012).
- Wessels, H. J., et al. Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling. PLoS ONE. 8 (7), e68340 (2013).
- Wöhlbrand, L., et al. Analysis of membrane-protein complexes of the marine sulfate reducer Desulfobacula toluolica Tol2 by 1D blue native-PAGE complexome profiling and 2D blue native-/SDS-PAGE. Proteomics. 16 (6), 973-988 (2016).
- Takabayashi, A., et al. PCoM-DB Update: A Protein Co-Migration Database for Photosynthetic Organisms. Plant and Cell Physiology. 58 (1), e10 (2017).
- Senkler, J., et al. The mitochondrial complexome of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 89 (6), 1079-1092 (2017).
- de Almeida, N. M., et al. Membrane-bound electron transport systems of an anammox bacterium: A complexome analysis. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (10), 1694-1704 (2016).
- Anand, R., Strecker, V., Urbach, J., Wittig, I., Reichert, A. S. Mic13 Is Essential for Formation of Crista Junctions in Mammalian Cells. PLoS ONE. 11 (8), e0160258 (2016).
- Eydt, K., Davies, K. M., Behrendt, C., Wittig, I., Reichert, A. S. Cristae architecture is determined by an interplay of the MICOS complex and the F1FO ATP synthase via Mic27 and Mic10. Microbial Cell. 4 (8), 259-272 (2017).
- Müller, C. S., et al. Cryoslicing Blue Native-Mass Spectrometry (csBN-MS), a Novel Technology for High Resolution Complexome Profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 669-681 (2016).
- Castonguay, J., et al. The two-pore channel TPC1 is required for efficient protein processing through early and recycling endosomes. Scientific Reports. 7 (1), 10038 (2017).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).
- Banyard, S. H., Stammers, D. K., Harrison, P. M. Electron density map of apoferritin at 2.8-A resolution. Nature. 271 (5642), 282-284 (1978).
- Dettmer, U., et al. Transmembrane protein 147 (TMEM147) is a novel component of the Nicalin-NOMO protein complex. The Journal of Biological Chemistry. 285 (34), 26174-26181 (2010).
- Kimberly, W. T., et al. Gamma-secretase is a membrane protein complex comprised of presenilin, nicastrin Aph-1, and Pen-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6382-6387 (2003).
- Hong, Y., et al. Human PIG-U and yeast Cdc91p are the fifth subunit of GPI transamidase that attaches GPI-anchors to proteins. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1780-1789 (2003).
- Van Damme, T., et al. Mutations in ATP6V1E1 or ATP6V1A Cause Autosomal-Recessive Cutis Laxa. The American Journal of Human Genetics. 100 (2), 216-227 (2017).
- Budenholzer, L., Cheng, C. L., Li, Y., Hochstrasser, M. Proteasome Structure and Assembly. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3500-3524 (2017).
- Heusel, M., et al. Complex-centric proteome profiling by SEC-SWATH-MS. Molecular Systems Biology. 15 (1), e8438 (2019).
- Kristensen, A. R., Gsponer, J., Forster, L. J. A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome. Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).
