BN-MS 분석에 의한 고분해능 컴플렉스 프로파일링
Summary
마이크로톰을 이용한 다목적 저온 분석 BN-MS 프로토콜이 고분해능 복합체 프로파일링을 위해 제시된다.
Abstract
단백질은 일반적으로 다른 단백질과의 상호 작용을 통해 생물학적 기능을 발휘, 동적 단백질 어셈블리또는 안정적으로 형성 된 복합물의 일부로. 후자는 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(BN-PAGE)을 사용하여 분자 크기에 따라 우아하게 해결될 수 있다. 이러한 분리를 민감한 질량 분석법(BN-MS)에 결합하는 것은 잘 확립되었으며 이론적으로 생물학적 샘플에서 추출 가능한 복합체의 철저한 평가를 가능하게 합니다. 그러나 이 방법은 다소 힘들고 제한된 복잡한 크기 해상도및 감도를 제공합니다. 또한, 그것의 응용 프로그램은 풍부한 미토 콘 드리 아 및 석 고 단백질에 제한 남아 있다. 따라서, 단백질의 대다수를 위해, 안정한 단백질 복합체로의 통합에 관하여 정보는 아직도 부족합니다. 여기에 제시된 것은 예비 규모 BN-PAGE 분리, 저온 마이크로톤 슬라이싱에 의한 넓은 겔 레인의 서브 밀리미터 샘플링, 라벨없는 단백질 정량화를 통해 질량 분광 분석으로 구성된 복합체 프로파일링을 위한 최적화된 접근법입니다. 중요한 단계에 대한 절차와 도구에 대해 자세히 설명합니다. 응용 프로그램으로, 보고는 마우스 신장에서 용해된 endosome 농축된 막 분획의 복합성 분석을 기술합니다, 총 2,545개의 단백질을 단면도했습니다. 이 결과는 세포내 이온 채널과 같은 균일하고 풍부한 막 단백질뿐만 아니라 글리코실화 이소폼을 포함한 고분해능, 복잡한 단백질 조립 패턴의 식별을 입증합니다. 결과는 독립적인 생화학 적 분석과 일치합니다. 요약하면, 이 방법론은 단백질 (슈퍼) 복합체 및 그 하위 단위 조성물의 포괄적이고 편견없는 식별을 허용하여 모든 단백질 복합체의 조직체측정법, 조립 및 상호 작용 역학을 조사하기위한 기초를 제공합니다. 생물학적 시스템.
Introduction
BN-PAGE 분리는 먼저 BN-PAGE 겔 레인의 수동 슬라이스를 사용하여 Majeran1 및 Wessels2 연구 그룹에 의해 LC-MS 분석(BN-MS)에 직접 결합되었습니다. 그들의 분석은 식물 석고와 HEK 세포 미토콘드리아에서 알려진 소단위 조성물을 가진 풍부한 막 단백질 복합체의 수를 각각 확인했습니다. 그러나 이러한 분석은 포괄적인 분석과는 거리가 멀었고 새로운 어셈블리를 편견 없이 식별할 수 없었습니다. 질량 분석기 및 라벨없는 정량화 방법의 성능은 그 이후로 상당히 향상되어 포괄적 인 BN-MS 분석을 가능하게했습니다. 이것은 용어 “복합프로파일링”을 만들어 주었습니다. 예를 들어, Heide와 동료들은 464개의 미토콘드리아 단백질을 식별하고 클러스터링하여 많은 알려진 어셈블리를 확인하여 쥐 심장 미토콘드리아를 분석했습니다. 또한, 그들은 TMEM126B가 특정 어셈블리 컴플렉스3의참신규하고 중요한 하위 단위로 발견했습니다. 비교 결과 (와 437 미토 콘 드리 아 단백질 프로필) HEK 세포 미토 콘 드리 아의 병렬 연구에서 얻은4.
이러한 개선에도 불구하고, 복잡한 프로파일링을 위한 BN-MS의 잠재력을 최대한 억제하는 몇 가지 문제가 남아 있습니다. 주요 제한은 두 가지 요인에 의해 결정되는 복합체의 유효 크기 분해능입니다: (i) BN-PAGE 분리의 품질, 이는 겔 매트릭스 기공 구배의 균일성뿐만 아니라 시료 복합체의 안정성/용해도에 따라 달라집니다. (ii) 기존의 수동 슬라이스5,6을사용할 때 최고의 1mm인 겔 샘플링의 단계 크기. 가난한 크기 해상도는 미묘한 복잡한 등소폼과 이질성을 놓칠뿐만 아니라 편견없는 de novo 하위 단위 할당 및 정량화의 동적 범위와 신뢰도에 부정적인 영향을 미칩니다.
그밖 과제는 질량 분광 분석에 의하여 견본에 있는 단백질 풍부의 실제 동적 범위의 단백질 정량화 그리고 엄호의 정밀도를 포함합니다. 따라서 BN-MS 복합체 프로파일링의 적용은 복잡성이 낮고, 표적 복합체의 발현이 높으며, 용해 특성(즉, 플라스티드, 미토콘드리아) 및 미생물)6,7,8,9,10.
우리는 최근에 포괄적인 MS 분석및 높은 단백질 단면도의 측정을 위한 정교한 MS 데이터 처리를 가진 BN-PAGE 젤 레인의 정밀한 서브 밀리미터 샘플링을 결합한 저온 균 슬라이스 지원 BN-MS (csBN-MS)를 소개했습니다. 신뢰도 11. 쥐 뇌로부터미토콘드리아 막 제제에 적용하여 이전에 충족되지 않은 유효 복합크기 분해능 및 산화호흡사슬 복합체(OXPHOS) 소단위(즉, 90MS-접근성)의 최대 커버리지를 입증하였다. 이 예는 또한 다수의 신규한 단백질 어셈블리를 확인했습니다.
여기서 설명한 것은 단백질 복합체의 예비 규모 BN-PAGE 분리(특정 생물학적 공급원에 국한되지 않음), 대형 예비 BN-PAGE 겔 주조, 광범위한 겔 레인의 극저온 균사체 슬라이스 및 MS 데이터에 대한 최적화된 절차입니다. 처리. 고분해능 프로파일링의 성능은 마우스 신장 내인성 농축 막으로부터의 단백질 복합 제제에 대해 입증된다. 마지막으로, 질량 분광 정량화의 분해능 및 정밀도 증가의 이점에 대해 논의합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 연구 결과는 이전에 미토콘드리아 제제11로 벤치마킹된 csBN-MS 기술에 기초하고 견본 준비, 젤 처리 및 MS 데이터 평가에 있는 개선을 통합했습니다. 대규모 분리 BN-PAGE 겔의 섹션에 대한 집중 분석은 미토콘드리아 멤브레인을 가진 연구에 필적하는 품질 측정값을 보여주는 포괄적인 데이터 세트를 제공했습니다. 질량 및 유지 시간 오류뿐만 아니라 실행 -투 – 실행 변이가 매우 낮게 유지되었고 신뢰할 수있는 단백질 풍부 프로파일을 결정하기위한 기초를 제공했습니다. 크기 분해능은 6개의 슬라이스(1.5mm에 해당, 도 4에해당)의 절반 최대 피크 폭과 10% 미만의 상대크기 차이로 양호한 것으로 나타났습니다(그림3, 그림 5A). 이러한 값은 미토콘드리아의 이전 csBN-MS 분석의 크기 분해능 품질을 완전히 충족시키지 못했지만(선택된 더 작은 겔 샘플링 단계 크기에도 불구하고), 기존의 BN-MS 또는 크기 배제 MS의 성능보다 훨씬 우수합니다. 최근 인기를 끌고 있는20.
2D BN/SDS-PAGE 웨스턴 블롯 해석으로는 거의 해결할 수 없는 도 3(TPC1 관련 복합체 사용)의 시뮬레이션 실험에서 고효율 복합 크기 분해능의 중요성이 강조됩니다(그림1B). 이러한 결과는 이 경우 0.25mm 슬라이싱으로 인해 일부 오버샘플링이 발생했지만, 이는 여전히 유효 크기 분해능을 손상시키지 않으면서 “정량화 노이즈”를 제거하는 데 유용하다고 입증되었습니다. 따라서, 이전결과(11)에따라, ~0.3 mm의 샘플링 단계 크기는 일반적으로 권장된다.
특히, TPC1 관련 복합체의 차별은 종래의 BN-MS5,6에서수동 슬라이스에 의해 제공되는 가장 작은 단계 크기인 1 mm 겔 샘플링으로 완전히 손실된다. 이것은 강력한 MS 기술이 유효하고 있음에도 불구하고, 아주 몇몇 단백질 복합체 및 소단위가 복합체 프로파일링에 의해 de novo 확인되었다는 사실을 설명할 수 있습니다. csBN-MS는 좋은 해결 력 외에도 높은 다기능성을 제공합니다. 50 kDa에서 여러 MDa에 이르는 막 결합 복합체 및 수용성 단백질 복합체는 최소 바이어스11을사용하여 단일 실험에서 효과적으로 해결될 수 있다. 이것은 특정 크기 범위 또는 전하 속성을 가진 수용성 단백질의 하위 세트로 작동하는 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피와 같은 복합체 프로파일링에 사용되는 대체 분리 기술과 대조됩니다. 단점으로는 csBN-MS는 확장성이 낮으며(젤당 최대 하중 ~3 mg 단백질), 기술적으로 어려울 수 있으며 자동화할 수 없습니다.
전반적으로, 결과는 csBN-MS 기지를 둔 복합체 프로파일링이 비 미토콘드리아 표적에 성공적으로 적용될 수 있다는 것을 보여줍니다 그러나 또한 몇몇 관련되는 도전을 표시합니다. 따라서, 단백질 복합체의 효율적인 추출 및 생화학적 안정성은 보다 최적화되고, 세척 단계가 필요하며, 여전히 제한될 수 있다. 조사된 크기 창 내에서, 미토콘드리아 샘플에 비해 잘 집중된 단분산 단백질 복합체의 수는 실제로 상당히 낮았다(데이터는 도시되지 않음). 또한 허용 가능한 겔 분리를 얻기 위해 BN-PAGE 샘플 부하를 낮추는 것이 좋습니다. 하중이 높을수록 슬라이스를 위해 제대로 처리하기 어려운 더 넓은 젤 레인이 필요할 수 있습니다(함께 제공되는 비디오 참조). 더욱이, 시료의 단백질 복잡성은 미토콘드리아 유래 슬라이스 다이제스트보다 더 높았으며(약 2배) 더 많은 PV 값과 감소된 동적 범위로 이어졌다. 실제로, 도 5에 나타난 복합체의 일부가 될 것으로 예상되는 일부 작은 단백질은 분석에서 누락되었다. 이러한 문제는 더 빠르고 민감한 MS 계측기 또는 데이터 독립적 수집 모드를 사용하여 향후 해결될 수 있습니다.
시료 전제제는 단백질 복합성 검색, 안정성 및 젤 분리 품질에 매우 중요합니다. 파라미터 및 절차는 각 소스 조직, 세포 용해, 막 (분획) 및 관심 단백질 복합체에 대해 최적화되어야 합니다. csBN-MS의 응용 프로그램을 확장하는 데 도움이 될 수 있는 다음과 같은 일반적인 권장 사항이 제공됩니다.
(i) 신선한 샘플을 준비하고 온난화 / 동결, 강한 희석, 버퍼 조건의 변화 및 불필요한 지연을 피하십시오.
(ii) 본질적으로 염이 없는 완충제(500-750 mM 베타인 또는 아미노카프로산으로 대체), 중성 pH에 대해, 비변성 세제의 최대 1%(w/v)를 함유하고 있는 비변성 세제(단백질:1:10 사이의 세제 비율 1:4-10) 단백질 복합체, 수용성 단백질 복합체에 필요한 세제 없음);
(iii) 분석 BN-PAGE에 의한 세제 조건의 신중한 테스트 및 조정은 복잡한 용해의 효율, 시료의 막 단백질 복합체의 표현, 안정성 및 균질성에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 단백질 세제 미셀. 후자는 BN-PAGE 젤에 뚜렷한 밴드/복잡한 인구로 초점을 맞추기 위한 단백질을 위한 전제 조건입니다. 이전 문헌은 광범위한 중성 세제를 제공합니다. 그러나, DDM (n-dodecyl β-d-maltoside)1,2,4,5,6, 디지토닌3,5,7,8, 9,10,13,18은 지금까지 BN-MS 분석을 위한 가장 인기 있는 선택이었습니다. 임의의 세제 조건은 용해 효율과 단백질 상호 작용의 보존 사이의 절충을 나타내며 모든 유형의 표적 단백질 및 공급원 물질에 동등하게 적합하지 않을 수 있음을 강조해야 합니다.
(iv) 피브릴, 필라멘트, 폴리리신, DNA 및 풍부한 저분자 성분(즉, 대사산물, 지질 또는 펩타이드)과 같은 충전된 폴리머를 제거합니다. 이것은 초원심분리, 젤 여과, 또는 투석에 의해 달성될 수 있습니다. 이것은 총 세포 또는 조직 용해물특히 중요합니다;
(v) 쿠마시 G-250 추가 (최종 농도 0.05%-0.1%) 그리고 자당 (로딩을위한 밀도를 높이기 위해, 최종 농도 10 %-20 % [w /v]) 로딩 직전에 샘플에, 짧은 초원심분리에 의해 취소, 교란없이 샘플을로드하고, 그 후 즉시 실행을 시작합니다.
미래의 관점에서, csBN-MS 기반 의 안색 프로파일링은 특정 생물학적 조건과 관련된 단백질 복합 역학 또는 변화를 연구하기 위해 다중화에 대한 옵션을 제공합니다. 크기 배제 기반프로파일링(21)에 대해 제안된 바와 같이 대사표지된 시료의 결합분리는 간단해 보이지만, 사용된 분리와 는 별개로 발생하는 복합체에서의 자발적인 소단위 교환에 의해 방해받을 수 있다. 메서드. 또는, 라벨이 붙은 시료는 인접한 겔 레인에서 해결될 수 있으며, 이 차선은 높은 감도와 견고성을 갖춘 차동 분석을 위해 공동 슬라이스 또는 결합후 소화를 할 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 도이치 포르충스게마인샤프트(DFG, 독일 연구 재단)-프로젝트 ID 403222702 – SFB 1381 및 독일의 우수 전략 CIBSS – EXC-2189 – 프로젝트 ID 390939984에 의해 지원되었다. 우리는 기술 지원을 위한 Katja Zappe에게 감사드립니다.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio Rad | #1610158 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13% |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio Rad | #1610154 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13% |
| SYPRO Ruby Protein Blot Stain | Bio Rad | #1703127 | Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Serva | no. 35050 | Centrifugate stock solutions prior to use |
| ComplexioLyte 47 | Logopharm | CL-47-01 | Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins |
| Embedding Medium / Tissue Freezing Medium | Leica Biosystems | 14020108926 | Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome |
| Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm | Merck | IPVH00010 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml | n.a. | n.a. | any supplier, important for making gel section embedding tool |
| broad razor blade | n.a. | n.a. | any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes |
| metal tube / cylinder, ca. 4 cm long | n.a. | n.a. | mold for embedding and freezing of gel samples |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | Nr. 0030108116 | highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption |
| sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm | Dionex / Thermo Scientific | P/N 160454 | |
| PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm) | New Objective | FS360-75-8 | |
| ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm) | Dr. Maisch GmbH | r13.93. | columns packed manually |
| rabbit anti-TPC1 antibody | Gramsch Laboratories | custom production | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
| Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | CY-1300 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
| biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated | Vector Laboratories | #B1325 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
| cryo-microtome Leica CM1950 | Leica Biosystems | 14047743905 | |
| Mini Protean II Cell with wetblot unit | Bio Rad | n.a. | for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more) |
| Penguin Midi Gel Electrophoresis System | PeqLab | n.a. | for BN-PAGE (not sold any more) |
| Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera | Zeiss / Photometrics | n.a. | |
| peristaltic pump (IP high precision multichannel) | Ismatec | ISM940 | for casting of gradient polyacrylamide gels |
| gradient mixer with stirring (two chambers) | selfmade, alternatively Bio Rad | 1652000 or 1652001 | for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf) |
| ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor | Sorvall / Thermo Scientific | n.a. | for sample preparation (not sold any more) |
| UltiMate 3000 RSLCnano HPLC | Dionex / Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMAZQ |
References
- Majeran, W., et al. Consequences of C4 Differentiation for Chloroplast Membrane Proteomes in Maize Mesophyll and Bundle Sheath Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 7, 1609-1638 (2008).
- Wessels, H. J., et al. LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes. Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).
- Heide, H., et al. Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex. Cell Metabolism. 16 (4), 538-549 (2012).
- Wessels, H. J., et al. Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling. PLoS ONE. 8 (7), e68340 (2013).
- Wöhlbrand, L., et al. Analysis of membrane-protein complexes of the marine sulfate reducer Desulfobacula toluolica Tol2 by 1D blue native-PAGE complexome profiling and 2D blue native-/SDS-PAGE. Proteomics. 16 (6), 973-988 (2016).
- Takabayashi, A., et al. PCoM-DB Update: A Protein Co-Migration Database for Photosynthetic Organisms. Plant and Cell Physiology. 58 (1), e10 (2017).
- Senkler, J., et al. The mitochondrial complexome of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 89 (6), 1079-1092 (2017).
- de Almeida, N. M., et al. Membrane-bound electron transport systems of an anammox bacterium: A complexome analysis. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (10), 1694-1704 (2016).
- Anand, R., Strecker, V., Urbach, J., Wittig, I., Reichert, A. S. Mic13 Is Essential for Formation of Crista Junctions in Mammalian Cells. PLoS ONE. 11 (8), e0160258 (2016).
- Eydt, K., Davies, K. M., Behrendt, C., Wittig, I., Reichert, A. S. Cristae architecture is determined by an interplay of the MICOS complex and the F1FO ATP synthase via Mic27 and Mic10. Microbial Cell. 4 (8), 259-272 (2017).
- Müller, C. S., et al. Cryoslicing Blue Native-Mass Spectrometry (csBN-MS), a Novel Technology for High Resolution Complexome Profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 669-681 (2016).
- Castonguay, J., et al. The two-pore channel TPC1 is required for efficient protein processing through early and recycling endosomes. Scientific Reports. 7 (1), 10038 (2017).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).
- Banyard, S. H., Stammers, D. K., Harrison, P. M. Electron density map of apoferritin at 2.8-A resolution. Nature. 271 (5642), 282-284 (1978).
- Dettmer, U., et al. Transmembrane protein 147 (TMEM147) is a novel component of the Nicalin-NOMO protein complex. The Journal of Biological Chemistry. 285 (34), 26174-26181 (2010).
- Kimberly, W. T., et al. Gamma-secretase is a membrane protein complex comprised of presenilin, nicastrin Aph-1, and Pen-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6382-6387 (2003).
- Hong, Y., et al. Human PIG-U and yeast Cdc91p are the fifth subunit of GPI transamidase that attaches GPI-anchors to proteins. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1780-1789 (2003).
- Van Damme, T., et al. Mutations in ATP6V1E1 or ATP6V1A Cause Autosomal-Recessive Cutis Laxa. The American Journal of Human Genetics. 100 (2), 216-227 (2017).
- Budenholzer, L., Cheng, C. L., Li, Y., Hochstrasser, M. Proteasome Structure and Assembly. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3500-3524 (2017).
- Heusel, M., et al. Complex-centric proteome profiling by SEC-SWATH-MS. Molecular Systems Biology. 15 (1), e8438 (2019).
- Kristensen, A. R., Gsponer, J., Forster, L. J. A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome. Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).
