クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング
Summary
マイクロトームを用いて汎用性の高い解起性BN-MSプロトコルを高解像度の複合プロファイリング用に提示する。
Abstract
タンパク質は、一般に、動的タンパク質アセンブリまたは安定形成複合体の一部として、他のタンパク質との相互作用を通じて生物学的機能を発揮します。後者は、天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動(BN-PAGE)を用いて分子サイズに従ってエレガントに解決することができる。このような分離を敏感な質量分析(BN-MS)に結合することは十分に確立されており、理論的には生物学的サンプル中の抽出可能な錯体の徹底的な評価を可能にする。ただし、このアプローチはかなり面倒で、複雑なサイズの解像度と感度が限られています。また、その適用は豊富なミトコンドリアおよびプラスチドタンパク質に限定されたままである。したがって、大多数のタンパク質では、安定タンパク質複合体への統合に関する情報はまだ不足しています。ここでは、準備スケールのBN-PAGE分離、凍結ミクロトームスライスによる広範なゲルレーンのサブミリメートルサンプリング、ラベルフリータンパク質定量による質量分析を含む複合体プロファイリングに最適化されたアプローチを示します。重要な手順の手順とツールについて詳しく説明します。このアプリケーションとして、マウス腎臓からの可溶化エンドソーム富化膜画分の複合体解析について説明し、合計で2,545個のタンパク質をプロファイリングした。この結果は、細胞内イオンチャネルなどの均一で低ふさわしい膜タンパク質の同定と、グリコシル化アイソフォームを含む高解像度で複雑なタンパク質アセンブリパターンの同定を実証した。結果は独立した生化学的分析と一致している。要約すると、この方法論は、タンパク質(スーパー)複合体とそのサブユニット組成の包括的かつ公平な同定を可能にし、任意のタンパク質複合体の修行法、組み立て、および相互作用ダイナミクスを調査するための基礎を提供します。生物学的システム。
Introduction
BN-PAGE分離は、まず、BN-PAGEゲルレーンの手動スライスを使用してマジェラン1およびウェッセル2研究グループによってLC-MS分析(BN-MS)に直接結合されました。彼らの分析は、植物プラスティドとHEK細胞ミトコンドリアから既知のサブユニット組成を有する豊富な膜タンパク質複合体の数を同定した。しかし、これらの分析は包括的なものではなく、新しいアセンブリの公平な識別を可能にしませんでした。質量分析計とラベルフリー定量法の性能は、それ以来大幅に向上し、包括的なBN-MS分析を可能にしました。これは「コンプレックスプロファイリング」という用語を造語しました。例えば、ハイデと共同作業者は、ラット心臓ミトコンドリアを同定し、464個のミトコンドリアタンパク質をクラスタリングし、それによって多くの既知のアセンブリを確認した。さらに、彼らはTMEM126Bが特定のアセンブリ複合体3の新しい、重要なサブユニットであることを発見しました。同等の結果(437ミトコンドリアタンパク質プロファイルを有する)は、HEK細胞ミトコンドリア4の並列研究で得られた。
これらの改善にもかかわらず、複合プロファイリングのためのBN-MSの可能性を完全に抑制するいくつかの問題が残っています。主な制限は、2つの要因によって決定される複合体の有効なサイズ分解能です:(i)ゲルマトリックス細孔勾配の均一性とサンプル複合体の安定性/溶解性に依存するBN-PAGE分離の品質、および(ii)ゲルサンプリングのステップサイズは、従来の手動スライス5、6を使用する場合に最高の1mmである。サイズの解像度が低いだけでなく、微妙な複雑なアイソフォームや不均一性を見逃すだけでなく、偏りのない、de novo サブユニットの割り当てと定量化のダイナミックレンジと信頼にも悪影響を及ぼします。
その他の課題としては、タンパク質定量の精度と、質量分析によるサンプル中のタンパク質の豊富さの実際の動的範囲のカバレッジが含まれます。したがって、BN-MS錯体プロファイリングの適用は、より低い複雑性、標的複合体の高発現、および良好な可溶化特性(すなわち、プラスチド、ミトコンドリア、およびおよび有利な可溶化特性を有する生物学的試料に大きく制限されたままであった。微生物)6,7,8,9,10.
最近では、BN-PAGEゲルレーンの精密なサブミリメートルサンプリングと包括的なMS解析を組み合わせたクライオミクロトームスライスアシストBN-MS(csBN-MS)を導入し、高いタンパク質プロファイルの決定のための精巧なMSデータ処理を行いました。自信11.ラット脳からのミトコンドリア膜製剤への応用は、以前に満たされていない効果的な複合体サイズ分解能および酸化呼吸鎖複合体(OXPHOS)サブユニットの最大カバレッジ(すなわち、90 MSアクセス可能な90)を実証した。この例では、多数の新規タンパク質アセンブリも同定した。
ここでは、タンパク質複合体(特定の生物学的源に限定されない)の準備スケールBN-PAGE分離、大規模な準備BN-PAGEゲルの鋳造、広いゲルレーンのクライオミクロトームスライス、およびMSデータの最適化された手順を示します。処理。高解像度プロファイリングの性能は、マウス腎臓エンドソーム富化膜からのタンパク質複合体製剤について実証される。最後に、質量分析定量の分解能と精度を高めることによる利点について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究は、以前にミトコンドリア調製11でベンチマークしたcsBN-MS技術に基づいて構築された研究で、サンプル調製、ゲル処理、およびMSデータ評価の改善を組み込んだ。大規模分離BN-PAGEゲルのセクションの焦点を絞った分析は、ミトコンドリア膜との研究に匹敵する品質測定を示す包括的なデータセットを提供した。質量および保持時間の誤差および実行可能なバリエーションは非常に低く保たれ、信頼できるタンパク質の豊富なプロファイルを決定するための基礎を提供した。サイズの解像度は良好に見え、半分の最大ピーク幅は6枚(1.5mm、図4に相当)、相対的なサイズ差は10%未満です(図3、図5A)。これらの値は、ミトコンドリアの以前のcsBN-MS分析のサイズ分解能品質を完全に満たしていなかった(選択された小さいゲルサンプリングステップサイズにもかかわらず)が、従来のBN-MSまたはサイズ排除MSの性能よりも有意に優れている最近人気となっているアプローチ20。
高い有効な複雑なサイズ分解能の重要性は、図3のシミュレーション実験(TPC1関連複合体を用いて)によって強調され、2D BN/SDS-PAGEウェスタンブロット解析ではほとんど解決できない(図1B)。これらの結果は、この場合の0.25mmスライスがオーバーサンプリングをもたらしたことを示唆していますが、これは有効なサイズ分解能を損なうことなく「定量ノイズ」の除去に有用であることが判明しました。したがって、前の結果11に沿って、〜0.3mmのサンプリングステップサイズが一般的に推奨される。
特に、TPC1関連複合体の判分は、従来のBN-MS5、6で手動スライスによって提供される最小のステップサイズである1mmゲルサンプリングによって完全に失われます。これは、強力なMS技術が利用可能であるにもかかわらず、非常に少数のタンパク質複合体とサブユニットが複合体プロファイリングによってde novoを同定したという事実を説明するかもしれません。csBN-MSはよい解決力に加えて、高い多様性を提供する。50 kDaから複数のMDaに及ぶ膜結合複合体および可溶性タンパク質複合体は、最小バイアス11を用いて単一の実験で効果的に解決することができる。これは、サイズ排除やイオン交換クロマトグラフィーなどの複合体プロファイリングに使用される代替分離技術とは対照的であり、特定のサイズ範囲または電荷特性を有する可溶性タンパク質のサブセットで動作します。欠点として、csBN-MSはスケーラビリティが低く(ゲル当たり約3mgのタンパク質の最大負荷)、技術的に困難であり、自動化することはできません。
全体として、csBN-MSベースの錯体プロファイリングが非ミトコンドリアターゲットに正常に適用できるだけでなく、関連するいくつかの課題を示す結果が示されています。したがって、タンパク質複合体の効率的な抽出および生化学的安定性は、より多くの最適化を必要とし、洗浄工程は依然として制限されてもよい。調査されたサイズウィンドウ内では、ミトコンドリアサンプルと比較して、よく焦点を当てた単分散タンパク質複合体の数は実際にかなり低かった(図示されていないデータ)。また、許容可能なゲル分離を得るためにBN-PAGEサンプル負荷を下げることをお勧めします。負荷が高いほど、スライスのために適切に処理するのがより困難な、より広いゲルレーンが必要になる場合があります(付属のビデオを参照)。さらに、サンプルのタンパク質の複雑さは、ミトコンドリア由来のスライスダイジェストよりも高く(約2倍)、より多くの欠落したPV値と減少したダイナミックレンジにつながりました。実際、図5に示す複合体の一部であると予想されるいくつかの小さなタンパク質は、分析に欠けていました。これらの問題は、より高速で機密性の高い MS 計測器またはデータに依存しない取得モードを使用することで、将来的に解決できます。
サンプル調製は、タンパク質複合体の検索、安定性、およびゲル分離品質に非常に重要です。パラメータと手順は、各ソース組織、細胞リサート、膜(画分)、および目的のタンパク質複合体ごとに最適化する必要があります。csBN-MS のアプリケーションの拡張に役立つ一般的な推奨事項を次に示します。
(i) サンプルを新鮮に準備し、温暖化/凍結、強い希釈、バッファー条件の変化、および不必要な遅延を避ける。
(ii) 塩を本質的に欠損しているバッファー(500~750 mMベタインまたはアミノカプロン酸に置き換える)、中性pHについて、非型化洗剤(タンパク質:1:4-1:10の間の洗剤比1:1:10)を含有するタンパク質複合体、可溶性タンパク質複合体に必要な洗剤なし);
(iii) 分析BN-PAGEによる洗剤条件の慎重な試験と調整は、複雑な可溶化の効率、試料中の膜タンパク質複合体の表現、安定性、および均質性に強く影響を与える可能性があるため、タンパク質洗剤ミセル。後者は、タンパク質がBN-PAGEゲル上の異なるバンド/複合体集団として焦点を合わせるための前提条件です。以前の文献は、中性洗剤の広い範囲を提供しています。しかし、DDM(n-ドデシルβ-d-マルトシド)1、2、4、5、6およびデジボニン3、5、7、8、 9、10、13、18は、これまでのBN-MS分析のための最も人気のある選択肢となっています。洗剤の状態は、必ずしも溶化効率とタンパク質相互作用の保存との間の妥協を表し、すべてのタイプの標的タンパク質およびソース材料に等しく適していない可能性があることを強調する必要があります。
(iv)フィブリル、フィラメント、ポリリシン、DNA、および豊富な低分子量成分(すなわち、代謝産物、脂質、またはペプチド)のような帯電したポリマーを除去する。これは、超遠心分離、ゲル濾過、または透析によって達成されてもよい。これは、総細胞または組織のリサテスのために特に重要です。
(v) クマシーG-250の添加(最終濃度0.05%-0.1%)スクロース(積載密度を高めるために、最終濃度10%-20%[w/v])を装填直前のサンプルに、短い超遠心分離によってクリアし、摂動することなくサンプルをロードし、その直後に実行を開始する。
将来の視点として、csBN-MSベースの複合体プロファイリングは、タンパク質複合体のダイナミクスや特定の生物学的条件に関連する変化を研究するための多重化のためのオプションを提供します。サイズ除外ベースのプロファイリング21のために提案された代謝ラベル付きサンプルの組み合わせ分離は簡単に見えますが、使用された分離とは独立して起こる複合体における自発的なサブユニット交換によって妨げられる可能性があります。メソッド。あるいは、ラベル付きサンプルは隣接するゲルレーンで解決することができ、高感度と堅牢性を持つ差動分析のために消化後にコスライスまたは組み合わせることができます。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(DFG、ドイツ研究財団)-プロジェクトID 403222702 – SFB 1381およびドイツのエクセレンス戦略CIBSS – EXC-2189 – プロジェクトID 390939984によってサポートされました。私たちは、技術支援のためにカジャザッペに感謝します。
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio Rad | #1610158 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13% |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio Rad | #1610154 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13% |
| SYPRO Ruby Protein Blot Stain | Bio Rad | #1703127 | Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Serva | no. 35050 | Centrifugate stock solutions prior to use |
| ComplexioLyte 47 | Logopharm | CL-47-01 | Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins |
| Embedding Medium / Tissue Freezing Medium | Leica Biosystems | 14020108926 | Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome |
| Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm | Merck | IPVH00010 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml | n.a. | n.a. | any supplier, important for making gel section embedding tool |
| broad razor blade | n.a. | n.a. | any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes |
| metal tube / cylinder, ca. 4 cm long | n.a. | n.a. | mold for embedding and freezing of gel samples |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | Nr. 0030108116 | highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption |
| sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm | Dionex / Thermo Scientific | P/N 160454 | |
| PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm) | New Objective | FS360-75-8 | |
| ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm) | Dr. Maisch GmbH | r13.93. | columns packed manually |
| rabbit anti-TPC1 antibody | Gramsch Laboratories | custom production | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
| Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | CY-1300 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
| biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated | Vector Laboratories | #B1325 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
| cryo-microtome Leica CM1950 | Leica Biosystems | 14047743905 | |
| Mini Protean II Cell with wetblot unit | Bio Rad | n.a. | for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more) |
| Penguin Midi Gel Electrophoresis System | PeqLab | n.a. | for BN-PAGE (not sold any more) |
| Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera | Zeiss / Photometrics | n.a. | |
| peristaltic pump (IP high precision multichannel) | Ismatec | ISM940 | for casting of gradient polyacrylamide gels |
| gradient mixer with stirring (two chambers) | selfmade, alternatively Bio Rad | 1652000 or 1652001 | for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf) |
| ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor | Sorvall / Thermo Scientific | n.a. | for sample preparation (not sold any more) |
| UltiMate 3000 RSLCnano HPLC | Dionex / Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMAZQ |
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