Представлен протокол для производства различных типов среднего нерва (MN) поражений и ремонта у крысы. Кроме того, протокол показывает, как оценить функциональное восстановление нерва с помощью нескольких неинвазивных поведенческих тестов и физиологических измерений.
Основная цель этого исследования заключается в том, чтобы показать, как создать и восстановить различные типы средних поражений нерва (MN) у крысы. Кроме того, представлены различные методы имитации послеоперационной физиотерапии. Для оценки двигательного и сенсорного восстановления используются различные стандартизированные стратегии с использованием модели MN периферического поражения и ремонта нерва, что позволяет легко сравнивать результаты. Несколько вариантов включены для обеспечения послеоперационной физиотерапии, как окружающая среда для крыс, которые подверглись травмам MN. Наконец, в документе представлен метод оценки восстановления MN с помощью нескольких неинвазивных тестов (т.е. схватка тест, контактный укол тест, лестница ступенька ходьба тест, веревочные альпинистские тест, и ходьба трек анализа), а также физиологические измерения (инфракрасная термография, электронейромиография, оценка силы сгибания, и сгибатель карпи радиалис определение веса мышцы). Таким образом, эта модель представляется особенно уместной для воспроизведения клинического сценария, облегчающего экстраполяцию результатов на человеческий вид.
Хотя седалищный нерв является наиболее изученным нервом в периферических исследованиях нерва, анализ крысы MN представляет различные преимущества. Например, в исследованиях на орезыни елей МН наблюдается снижение частоты совместных контрактур и автомутации пораженной конечности. Кроме того, MN не покрывается мышечной массы, что делает его вскрытие легче, чем у седалищного нерва. Кроме того, восстановление MN наблюдается раньше, потому что МН короче, чем седалищее нерв. Кроме того, MN имеет параллельный путь к локтевого нерва в руке. Таким образом, локтевого нерва можно легко использовать в качестве нервного трансплантата для ремонта травм MN. Наконец, MN у крыс находится в передний конечности, сродни верхней конечности человека; у людей, верхняя конечность является местом большинства периферических поражений нерва.
Периферических нервных поражений происходят регулярно в результате травмы, инфекции, васкулит, аутоиммунные заболевания, злокачественности, и / или лучевой терапии1,2. К сожалению, периферийный ремонт нерва продолжает представлять клинически непредсказуемые и часто разочаровывающие результаты3,4. Существует широко распространенный консенсус, что значительные основные и трансляционные исследования по-прежнему необходимы для улучшения перспективы пострадавших4,5,6,7.
Крыса MN показывает большое сходство с людьми8,9 (Рисунок 1). Возникая из брахиального сплетения в подмышечной области, этот нерв опускается в медиальной аспект руки, достигая локтя, и разветвления до большинства мышц в брюшной отсек предплечья. MN достигает руки, где он innervates thenar мышц и первых двух люмбрикальных мышц, а также часть кожи рукикрысы 9 (Рисунок 1).
Используя крысу MN, можно адекватно воспроизвести периферических нервных поражений у людей10,,11,,12. Этот нерв имеет несколько потенциальных преимуществ исследования по отношению к обычно используемому седалическому нерву. Потому что MN расположен в переднюю часть крыс (сродни человеческим верхним конечностям), он может быть поврежден экспериментально с гораздо меньшим воздействием на благополучие крысы, по сравнению с седалищного нерва, который innervates значительную часть тазовой конечности13. Кроме того, у людей большинство клинических поражений происходит в верхней конечности, что соответствует передний конечностикрысы 10,11,,12,14,15,16.
В этой статье показано, как производить различные типы поражений MN у крыс. Кроме того, представлены различные способы имитации послеоперационной физиотерапии. Наконец, описаны тесты для оценки функционального восстановления MN. Существует несколько стандартизированных стратегий для оценки двигательного и сенсорного восстановления с использованием модели MN поражения и ремонта периферического нерва, что позволяет легко сравнивать результаты. Модель MN особенно подходит для воспроизведения клинического сценария, способствуя экстраполяции результатов на человеческий вид.
В этом документе представлен протокол для создания различных типов поражений MN и ремонта у крыс. Кроме того, он иллюстрирует, как оценить функциональное восстановление этого нерва с помощью нескольких неинвазивных поведенческих тестов и физиологических измерений.
Примечательно, что некоторые из функциональных тестов, описанных в этой работе, а именно Лестница Бег испытаний и веревки испытаний, в значительной степени зависит от готовности крысы для выполнения задачи в надежде на получение продовольственной награды51,52,53. Следует отметить, что некоторые штаммы крыс более поддаются обучению и выполнению воспроизводимых в этом типе тестов51,,52,,53. Например, Крысы Льюиса плохо работают в этих тестах как на этапеобучения,так и в51,52,,53.
Крыса жилья должны позволить достаточно свободы передвижения в соответствии с их естественным поведением разведки, в дополнение к позволяя экспериментальных животных, чтобы ознакомиться с некоторыми из элементов, присутствующих в функциональных тестов19. Таким образом, показаны различные формы жилья, позволяющие более высокую свободу передвижения. Большие клетки персонализированы с элементами обогащения, которые позже используются в функциональных тестах (например, веревки и лестницы).
Возможно, эти обогащающие элементы, а также клетки с включенными ходячими колесами и индивидуальными тренировочными сферами обеспечивают форму послеоперационной физиотерапии, аналогичную той, которая предлагается пациентам, работающим на периферической нервной системе10.
Примечательно, что, хотя некоторые авторы выступают врассекая подкожные ткани и мышечные фасции прямо или путем чистой резки с скальпелем номер 15, использование термокаутерии при вскрытии этих структур рекомендуется, чтобы свести к минимуму риск послеоперационной гематомы.
Следует отметить, что многочисленные тесты были разработаны для проверки различных аспектов периферического восстановления нерва у крысы, а именно аксональной регенерации, реиннервации цели, и функциональное восстановление, некоторые из которых выходят за рамки этого исследования29,54,55,56. Например, кинематический анализ29,,36,,55 и гистоморфеметрическая оценка29,,36,,57 широко используются несколькими авторами. Кроме того, некоторые из этих тестов включают вариации для максимизации эффективности и/или воспроизводимости54. Например, механическая алгиземетрия (т.е. оценка реакции на механические болезненные стимулы) может быть оценена качественно с помощью данной нити фон Фрея, как описано в настоящей работе, или полуколичественно используя последовательно более сильные нити фон Фрея, или даже количественно с помощью электронных устройств, которые применяют растущее давление до тех пор, пока ответ на вывод не наблюдается30,54.
Аналогичным образом, хотя некоторые авторы используют анализ пешеходных дорожек для оценки восстановления предплеки нерва у крысы, другие авторы утверждают, что одно поражения MN часто не производят воспроизводимые изменения в отпечатках лап10,58,59. Кроме того, некоторые из них заявили, что эти изменения не могут быть пропорциональны восстановлению мышц10,60. Принимая это в виду, некоторые исследователи выступали за использование анализа пешеходных дорожек в передний план главным образом при оценке восстановления после дробления неве поражений, а не после сегментальной реконструкции нерва10,50,61.
Grasping Test широко используется для оценки восстановления моторики мышц, контролируемых MN16,27. Для обеспечения единообразия и воспроизводимости данных, полученных с помощью этого теста, рекомендуется применять тест grasping Test с использованием устоявшейся методологии, предложенной Bertelli et al.16. Тем не менее, текущий протокол отличаетсятем,что он обычно не обездвижить контралатеральную лапу, чтобы предотвратить неоправданный стресс11,27. Следует также отметить, что другие авторы, после обездвиживания невредимой лапы, количественно оценить Grasping Test с помощью динамометра или шкалы27,56. Тем не менее, эта количественная оценка может зависеть от силы исследователь относится к хвостукрысы 26. Кроме того, трудно отличить силу, генерируемую цифровыми мышцами сгибателя (единственно invated MN в крысы и объект Grasping Test9) от силы, производимой запястья сгибатели, которые включают сгибатель карпи локтевой, который получает его innervation от локтевой нерв9,10,27. Для того, чтобы попытаться обойти эти потенциальные предубеждения, этот протокол использует порядковую шкалу, похожую на шкалу Медицинского научно-исследовательского совета, обычно используемую для оценки мышечной силы у людей10,11,62. Кроме того, другие авторы описали подробную оценку захвата с помощью видео-анализа и видео-системы скоринга11,63.
Потенциальным недостатком использования MN по сравнению с седалищем нервом является то, что большее количество информации имеется в отношении последнего нерва. Это, в свою очередь, может сделать сравнение данных, полученных с MN с предыдущими экспериментальными работами сложнее46,48,64. Кроме того, меньший размер MN по сравнению с седалиса цирващение делает хирургические манипуляции болеесложными8,12,27,56,65.
Вопреки методологии, описанной в настоящей статье, электронейромиография оценки может быть выполнена с помощью транскожных монополярных электродов, помещенных в руку и thenar регионов51. Несмотря на то, что менее инвазивным, этот метод несет в себе риск потенциальной путаницы из-за возможности костимуляции локтевого нерва в области рук9,51.
Большинство авторов согласны с тем, что не все тесты, используемые в крысы обеспечивают соответствующие результаты, как периферийный ремонт нерва зависит от комплекса факторов, включающих выживаемость нейронов, аксональной удлинение и обрезка, синаптогенез, успешный захват отрицательных органов чувств и моторных единиц, и пластика мозга7,10,50,66.67
Наконец, следует отметить, что значительное предостережение моделей грызунов заключается в том, что крысиные периферийные нервы гораздо ближе к своим конечным органам и имеют гораздо меньшие поперечные участки, чем гомологичные человеческие структуры. Тем не менее, эта разница в размерах гарантирует более быстрые экспериментальные данные у грызунов, и лучшие общие результаты у крыс по сравнению с людьми следует ожидать68. Действительно, некоторые авторы предупреждают, что помощь должна быть использована при попытке экстраполировать экспериментальные данные, полученные в периферических нерва ремонт с использованием грызунов для людей7,69. Модели Primate считаются более сопоставимыми70. Тем не менее, их использование связано с досадными этическими, материально-техническими и бюджетными ограничениями71.
Несмотря на то, что седалищный нерв является наиболее часто используемым нервом в периферических исследованиях нерва, крыса MN представляет множество преимуществ. Например, поражения MN связаны с меньшей частотой совместных контрактур и автомутации пораженной лапы11,,12,,16,,56. Примечательно, что автотомия после седалищного нерва транссекции поражает 11-70% крыс. Это может сделать текущие оценки, как седалитарный индекс невозможно14. Это, в свою очередь, делает оценку количества животных, необходимых для получения данной статистической мощности громоздким15.
Кроме того, так как МН короче седалищего нерва, восстановление нерва наблюдается раньше58,,72,,73,,74,,75,76. Кроме того, MN не покрывается мышечной массы, что делает его вскрытие технически легче, чем у седалищного нерва16. Кроме того, MN имеет параллельный путь к локтевом умыслу в руке. Таким образом, локтевой нерв может быть легко использован в качестве нервного трансплантата для ремонта травм MN. Наконец, у людей, большинство периферических поражений нерва происходят в верхней конечности, что еще больше поддерживает использование этого нерва в крысы77,78.
Возможно, грызуны являются экспериментальными животными, наиболее часто используемыми в области периферического ремонта нерва48,79. Как показано на рисунке, крыса MN является удобной моделью поражения периферического нерва и ремонта. В самом деле, Есть несколько стандартизированных стратегий, доступных для оценки двигателя и сенсорного восстановления, что позволяет легче сравнение результатов36,46,60,80,81,82. Многие из этих методов являются неинвазивными, что позволяет ежедневно оценивать.
Кроме того, физиотерапия является частью стандарта ухода за пациентами, восстанавливающимися после травм периферических нервов. Как показано в этой работе, Есть несколько стратегий, чтобы обеспечить послеоперационной физиотерапии, как окружающая среда для крыс, представленных на Травмы MN4,5. Таким образом, эта модель особенно подходит для репликации клинического сценария, облегчая экстраполяцию результатов на человеческий вид12,,27,,48,56,58,83.
Как показано в настоящем документе, доступны несколько стандартизированных стратегий для оценки двигательного и сенсорного восстановления в модели MN крысы. Большинство из них являются неинвазивными процедурами, позволяющими проводить частую оценку. Кроме того, поскольку большинство периферических поражений нерва у человеческого вида происходят в верхней конечности, упомянутые экспериментальные настройки физиотерапии могут более метко имитировать восстановление в клиническом контексте. Возможно, это может способствовать экстраполяции результатов для человеческого вида, дальнейшее подтверждение использования этого нерва в крысы.
The authors have nothing to disclose.
Диого Казаль получил грант от Программы дополнительного медицинского образования, которая спонсируется Фондом Калусте Гульбенкяном, Фандао Шампалимо, Министерио да Сааде-е Фанмансиа-пара-Кьенсия-е Tecnologia, Португалия. Авторы очень благодарны г-н Филипе Франко за иллюстративный рисунок на рисунке 1. Авторы хотели бы поблагодарить техническую помощь г-на Альберто Северино в съемках и редактировании видео. Наконец, авторы хотели бы поблагодарить г-жу Сару Маркес за ее помощь во всех материально-технических аспектах, относящихся к приобретению и содержанию животных.
Acetaminophen | Amazon | https://www.amazon.com/Childrens-Tylenol-grape-flavor-ages/dp/B0051VVVZG | |
Acland clamps | Fine Science Tools | 00398 V | http://www.merciansurgical.com/aclandclamps.pdf |
Acland Single Clamps B-1V (Pair) | Fine Science Tools | 396 | http://www.merciansurgical.com |
Biogel Surgical Gloves | Medex Supply | 30465 | https://www.medexsupply.com |
BSL Analysis | BIOPAC Systems | https://www.biopac.com/ | |
Castroviejo needle holders | Fine Science Tools | 12565-14 | http://s-and-t.ne |
Clamp applicator | Fine Science Tools | CAF-4 | http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf |
Constante voltage stimulator | BIOPAC Systems | STM200 | https://www.biopac.com/product/constant-voltage-stimulator-unipolar-pulse/ |
Cutasept skin disinfectant | Bode Chemie | http://www.productcatalogue.bode-chemie.com/products/skin/cutasept_f.php | |
Dafilon 10-0 | G1118099 | http://www.bbraun.com/cps/rde/xchg/bbraun-com/hs.xsl/products.html?prid=PRID00000816 | |
Derf Needle Holders 12 cm TC | Fine Science Tools | 703DE12 | http://www.merciansurgical.com |
Dry heat sterilizer | Quirumed | 2432 | http://www.quirumed.com/pt/material-de-esterilizac-o/esterilizadores |
Dynamometer | SAUTER | FH5 | https://www.sauter.eu/shop/en/measuring-instruments/force-measurement/FH-S/ |
Electroneuromiography setup | BIOPAC Systems | MP36 | https://www.biopac.com/product/biopac-student-lab-basic-systems/ |
Ethilon 5-0 | W1618 | http://www.farlamedical.co.uk/ | |
FLIR Software | FLIR | ||
Graeffe forceps 0.8 mm tips curved | Fine Science Tools | 11052-10 | http://www.finescience.de |
Graph paper | Ambar | ||
Heat Lamp HL-1 | Harvard Apparatus | 727562 | https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613 |
Heparin Sodium Solution (Heparin LEO 10000IU/ml) | Universal Drugstore | http://www.universaldrugstore.com/medications/Heparin+LEO/10000IU%2Fml | |
High-Temperature Cautery | Fine Science Tools | AA03 | http://www.boviemedical.com/products_aaroncauteries_high.asp |
Homeothermic Blanket System with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507220F | https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613 |
Infrared camera | FLIR | E6 | http://www.flir.eu/instruments/e6-wifi/ |
Instrapac – Adson Toothed Forceps (Extra Fine) | Fine Science Tools | 7973 | http://www.millermedicalsupplies.com |
Iris Scissors 11.5 cm Curves EASY-CUT | Fine Science Tools | EA7613-11 | http://www.merciansurgical.com |
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma- Aldrich | K113 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/k113?lang=pt®ion=PT |
Lacri-lube Eye Ointment 5g | Express Chemist | LAC101F | http://www.expresschemist.co.uk/lacri-lube-eye-ointment-5g.html |
Mayo Scissors 14 cm Straight Chamfered Blades EASY-CUT | Fine Science Tools | EA7652-14 | http://www.merciansurgical.com |
Meloxicam | Recropharma | Mobic | https://www.recropharma.com/product-pipeline/meloxicam |
Methylene Blue solution | Sigma- Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product | |
Micro Jewellers Forceps 11 cm straight 00108 | Fine Science Tools | JF-5 | http://www.merciansurgical.com |
Micro Jewellers Forceps 11cm angulated 00109 | Fine Science Tools | JFA-5b | http://www.merciansurgical.com |
Micro retractor | Fine Science Tools | RS-6540 | http://www.finescience.de |
Micro Scissors Round Handles 15 cm Straight | Fine Science Tools | 67 | http://www.merciansurgical.com |
Micro-vessel dilators 11 cm 0.3 mm tips 00124 | Fine Science Tools | D-5a.2 | http://www.merciansurgical.com |
Monosyn 5-0 | 15423BR | http://www.mcfarlanemedical.com.au/15423BR/SUTURE-MONOSYN-5_or_0-16MM-70CM-(C0023423)-BOX_or_36/pd.php | |
Normal saline for irrigation | Hospira, Inc. | 0409-6138-22 | http://www.hospira.com/en/search?q=sodium+chloride+irrigation%2C+usp&fq=contentType%3AProducts |
Operating microscope | Leica Surgical Microsystems | http://www.leica-microsystems.com/products/surgical-microscopes/ | |
Skin Skribe Surgical Skin Marker | Moore Medical | 31456 | https://www.mooremedical.com/index.cfm?/Skin-Skribe-Surgical-Skin-Marker/&PG=CTL&CS=HOM&FN=ProductDetail&PID=1740&spx=1 |
Snacks | Versele-Laga | Complete Crock-Berry | http://www.versele-laga.com/en/complete/products/complete-crock-berry |
Straight mosquito forcep | Fine Science Tools | 91308-12 | http://www.finescience.de |
Surgical drapes | Barrier | 800430 | http://www.molnlycke.com/surgical-drapes/ |
Veet Sensitive Skin Hair Removal Cream Aloe Vera and Vitamin E 100 ml | Veet | http://www.veet.co.uk/products/creams/creams/veet-hair-removal-cream-sensitive-skin/ |