Gepresenteerd is een protocol om verschillende soorten mediane zenuw (MN) laesies te produceren en reparatie in de rat. Bovendien laat het protocol zien hoe het functionele herstel van de zenuw kan worden geëvalueerd met behulp van verschillende niet-invasieve gedragstests en fysiologische metingen.
Het belangrijkste doel van dit onderzoek is om te laten zien hoe verschillende soorten mediane zenuwlaesies (MN) in de rat te creëren en te herstellen. Bovendien worden verschillende methoden gepresenteerd om postoperatieve fysiotherapie te simuleren. Meerdere gestandaardiseerde strategieën worden gebruikt om motorisch en zintuiglijk herstel te beoordelen met behulp van een MN-model van perifere zenuwlaesie en reparatie, waardoor een eenvoudige vergelijking van de resultaten mogelijk is. Verschillende opties zijn opgenomen voor het verstrekken van een postoperatieve fysiotherapie-achtige omgeving aan ratten die hebben ondergaan MN verwondingen. Ten slotte biedt het papier een methode om het herstel van het MN te evalueren met behulp van verschillende niet-invasieve tests (d.w.z. grijptest, pinpriktest, laddersportlooptest, touwklimtest en loopspooranalyse) en fysiologische metingen (infraroodthermografie, electroneuromyografie, flexiesterkte-evaluatie en flexor carpi radialis spiergewichtbepaling). Daarom lijkt dit model bijzonder geschikt om een klinisch scenario te repliceren, waardoor extrapolatie van resultaten aan de menselijke soort wordt vergemakkelijkt.
Hoewel de heupzenuw is de meest bestudeerde zenuw in perifere zenuwonderzoek, analyse van de rat MN presenteert verschillende voordelen. Er is bijvoorbeeld een verminderde incidentie van gezamenlijke contractuuren en automutilatie van de aangetaste ledemaat in MN laesiestudies. Bovendien is het MN niet bedekt door spiermassas, waardoor de dissectie gemakkelijker is dan die van de heupzenuw. Bovendien wordt MN-herstel eerder waargenomen, omdat het MN korter is dan de heupzenuw. Ook heeft de MN een parallel pad naar de ulnar zenuw in de arm. Vandaar, kan de ulnarzenuw gemakkelijk als zenuwtransplantaat voor het herstellen van verwondingen MN worden gebruikt. Ten slotte bevindt het MN zich bij ratten in de voorpoot, verwant aan de menselijke bovenste ledemaat; bij mensen is de bovenste ledemaat de plaats van de meeste perifere zenuwletsels.
Perifere zenuwletsels komen regelmatig voor als gevolg van trauma, infectie, vasculitis, auto-immuniteit, maligniteit en/of radiotherapie1,2. Helaas, perifere zenuwreparatie blijft klinisch onvoorspelbaar en vaak teleurstellende resultatenaanwezig 3,4. Men is het er algemeen over eens dat er nog steeds veel fundamenteel en translationeel onderzoek nodig is om het vooruitzicht van de betrokkenen te verbeteren4,5,6,7.
De rat MN vertoont grote gelijkenissen met die van mensen8,9 ( Figuur1). Afkomstig uit de brachial plexus in het okselgebied, daalt deze zenuw af in het mediale aspect van de arm, het bereiken van de elleboog, en vertakking af naar de meerderheid van de spieren in het ventrale compartiment van de onderarm. MN bereikt de hand, waar het de thenarspieren en de eerste twee lumbricalspieren evenals aan een deel van de handhuid 9 van de ratbinnenvates (Figuur 1).
Met behulp van de rat MN, is het mogelijk om voldoende te repliceren perifere zenuwlaesies bij de mens10,11,12. Deze zenuw heeft verschillende potentiële onderzoeksvoordelen ten opzichte van de gewoonlijk gebruikte heupzenuw. Omdat de MN zich in de voorpoot van ratten bevindt (verwant aan de menselijke bovenste ledematen), kan het experimenteel worden beschadigd met een veel kleinere impact op het welzijn van de rat, in vergelijking met de heupzenuw, die een aanzienlijk deel van de bekkenledemaatbinnenbrengt 13. Bovendien komen bij mensen de meeste klinische laesies voor in de bovenste ledemaat, wat overeenkomt met de voorpoot van de rat10,11,12,14,15,16.
Dit document laat zien hoe verschillende soorten MN laesies in de rat te produceren. Bovendien worden verschillende manieren gepresenteerd om postoperatieve fysiotherapie te simuleren. Ten slotte worden tests beschreven om het functionele herstel van het MN te evalueren. Er zijn meerdere gestandaardiseerde strategieën beschikbaar om motorisch en zintuiglijk herstel te beoordelen met behulp van een MN-model van perifere zenuwlaesie en reparatie, waardoor een eenvoudige vergelijking van de resultaten mogelijk is. Het MN-model is bijzonder geschikt om het klinische scenario te repliceren, waardoor extrapolatie van resultaten naar de menselijke soort wordt vergemakkelijkt.
Dit document presenteert een protocol om verschillende soorten MN laesies te creëren en reparatie in de rat. Bovendien illustreert het hoe het functionele herstel van deze zenuw te evalueren met behulp van verschillende niet-invasieve gedragstests en fysiologische metingen.
Met name zijn een aantal van de functionele tests beschreven in dit document, namelijk de Ladder Running Test en de Rope Test, aanzienlijk afhankelijk van de bereidheid van de rat om de taak uit te voeren met de verwachting van het verkrijgen van de voedselbeloning51,52,53. Er zij op gewezen dat bepaalde rattenstammen beter vatbaar zijn voor opleiding en het uitvoeren van reproduceerbare tests in dit soort tests51,52,53. Bijvoorbeeld, Lewis ratten presteren slecht in deze tests, zowel in de trainingsfase en vervolgens51,52,53.
De huisvesting van ratten zou voldoende vrijheid van verkeer in overeenstemming met hun natuurlijk verkennend gedrag moeten toestaan, naast het toestaan van experimentele dieren om vertrouwd te raken met enkele van de elementen die aanwezig zijn in de functionele tests19. Daarom worden verschillende vormen van huisvesting getoond die een hogere bewegingsvrijheid mogelijk maken. De grote kooien zijn gepersonaliseerd met verrijkingselementen die later in de functionele tests worden gebruikt (bijvoorbeeld touwen en ladders).
Ongetwijfeld bieden deze verrijkende elementen evenals de kooien met ingebouwde loopwielen en de individuele trainingssferen een vorm van postoperatieve fysiotherapie die vergelijkbaar is met die welke wordt aangeboden aan menselijke patiënten die op het perifere zenuwstelsel werkten10.
Aanzienlijk, hoewel sommige auteurs pleiten ontleden van de onderhuidse weefsels en spierfasciae botweg of door schoon snijden met een nummer 15 scalpel, het gebruik van thermocautery bij het ontleden van deze structuren wordt aanbevolen om het risico van postoperatieve hematoom te minimaliseren.
Er zij op gewezen dat er talrijke tests zijn ontwikkeld om verschillende aspecten van perifere zenuwherstel bij de rat te testen, namelijk axonale regeneratie, doelreinnervation en functioneel herstel, waarvan sommige buiten het bereik van deze studie vallen29,54,55,56. Kinematische analyse29,36,55 en histomorfometrische beoordeling29,36,57 worden bijvoorbeeld op grote schaal gebruikt door meerdere auteurs. Daarnaast omvatten verschillende van deze tests variaties om de efficiëntie en/of reproduceerbaarheid te maximaliseren54. Mechanische algisemetrie (d.w.z. evaluatie van reacties op mechanische pijnlijke stimuli) kan bijvoorbeeld kwalitatief worden beoordeeld met behulp van een bepaalde von Frey-gloeidraad, zoals beschreven in het huidige document, of semikwantitatief met behulp van achtereenvolgens sterkere von Frey-filamenten, of zelfs kwantitatief gebruik van elektronische apparaten die toenemende druk uitoefenen totdat een ontwenningsreactie wordt waargenomen30,54.
Evenzo, hoewel verschillende auteurs gebruik maken van walking track analyse om de voorpoot zenuwreparatie te evalueren in de rat, andere auteurs beweren dat enkele MN laesies vaak niet om reproduceerbare veranderingen in pawprints10produceren ,58,59. Bovendien hebben sommigen verklaard dat deze veranderingen niet evenredig kunnen zijn met spierherstel10,60. Met dit in het achterhoofd, hebben sommige onderzoekers gepleit voor het gebruik van walking track analyse in de voorpoot vooral bij de beoordeling van herstel na verpletterende neve laesies in plaats van na segmentale zenuwreconstructie10,50,61.
De Grasping Test wordt veel gebruikt om motorisch herstel van de spieren gecontroleerd door de MN16,27te evalueren. Om de uniformiteit en reproduceerbaarheid van de met deze test verkregen gegevens te waarborgen, wordt aanbevolen de graspingtest toe te passen volgens de beproefde methode die door Bertelli et al.16 wordt voorgesteld. Het huidige protocol verschilt echter in die zin dat het de contralaterale poot niet routinematig immobiliseert om onnodige stress te voorkomen11,27. Ook moet worden opgemerkt dat andere auteurs, na het immobiliseren van de niet-gewonde poot, de Grijptest kwantitatief beoordelen met behulp van een dynamometer of een schaal27,56. Deze kwantitatieve evaluatie kan echter worden beïnvloed door de sterkte die de onderzoeker toepast op de staart van de rat26. Bovendien is het moeilijk om onderscheid te maken tussen de kracht gegenereerd door de digitale flexor spieren (uitsluitend innervated door de MN in de rat en het object van de Grasping Test9) van de kracht geproduceerd door de pols flexoren, waaronder de flexor carpi ulnaris dat zijn innervatie ontvangt van de ulnar zenuw9,10,27. Om te proberen om deze potentiële vooroordelen te omzeilen, dit protocol maakt gebruik van een ordinale schaal vergelijkbaar met de Medical Research Council Schaal vaak gebruikt om spierkracht bij de mensrang 10,11,62. Als alternatief hebben andere auteurs gedetailleerde beoordeling van het grijpen met behulp van video-analyse en een video-gebaseerde score systeem11,63beschreven .
Een potentieel nadeel van het gebruik van de MN in vergelijking met de heupzenuw is dat een grotere hoeveelheid informatie beschikbaar is met betrekking tot de laatste zenuw. Dit kan op zijn beurt de vergelijking van de verkregen gegevens met het MN met die van eerdere experimentele werken moeilijker maken46,48,64. Bovendien maakt de kleinere omvang van het MN in vergelijking met de heupzenuw chirurgische manipulatie uitdagender8,12,27,56,65.
In tegenstelling tot de in dit document beschreven methodologie kan de evaluatie van de elektroneneuromyografie worden uitgevoerd met behulp van transcutane monopolaire elektroden die in de arm en thenargebieden51worden geplaatst. Ondanks het feit dat minder invasief, deze methode draagt het risico van mogelijke verwarring als gevolg van de mogelijkheid van costimulatie van de ulnar zenuw in het arm gebied9,51.
De meeste auteurs het erover eens dat niet alle tests die worden gebruikt in de rat bieden concordante resultaten, als perifere zenuw reparatie is afhankelijk van een complexe reeks van factoren, bestaande uit neuron overleving, axonale verlenging en snoeien, synaptogenese, succesvolle herovering van de gedenervateerde sensorische organen en motoreenheden, en de hersenen plasticiteit7,10,50,66,67.
Ten slotte moet worden opgemerkt dat een belangrijk voorbehoud van knaagdiermodellen is dat perifere zenuwen van ratten veel dichter bij hun eindorganen liggen en veel kleinere dwarsdoorsnedegebieden hebben dan de homologe menselijke structuren. Dit verschil in grootte garandeert echter snellere experimentele gegevens bij knaagdieren en betere algemene resultaten bij ratten in vergelijking met mensen zijn te verwachten68. Verschillende auteurs waarschuwen namelijk dat de zorg moet worden gebruikt wanneer zij proberen experimentele gegevens te extrapoleren die zijn verkregen in perifere zenuwreparatie met behulp van knaagdieren aan de mens7,69. Primatenmodellen worden beschouwd als meer vergelijkbaar70. Niettemin wordt het gebruik ervan geassocieerd met vervelende ethische, logistieke en budgettaire beperkingen71.
Hoewel de heupzenuw is de meest gebruikte zenuw in perifere zenuwonderzoek, de rat MN presenteert meerdere voordelen. MN-laesies worden bijvoorbeeld geassocieerd met een kleinere incidentie van gezamenlijke contractuuren en automutilatie van de aangetaste poot11,12,16,56. Aanzienlijk, autotomie na heupzenuw transsectie treft 11-70% van de ratten. Dit kan huidige evaluaties zoals de sciatische index onmogelijk maken14. Dit maakt op zijn beurt de schatting van het aantal dieren dat nodig is om een bepaald statistisch vermogen te verkrijgen omslachtig15.
Bovendien, aangezien het MN korter is dan de heupzenuw, wordt zenuwherstel eerder waargenomen58,72,73,74,75,76. Bovendien is de MN niet bedekt door spiermassas, waardoor de dissectie technisch gemakkelijker is dan die van de heupzenuw16. Bovendien heeft de MN een parallel pad naar de ulnar zenuw in de arm. Vandaar, kan de ulnarzenuw gemakkelijk als zenuwtransplantaat voor het herstellen van verwondingen MN worden gebruikt. Ten slotte komen bij mensen de meeste perifere zenuwlaesies voor in de bovenste ledemaat, die het gebruik van deze zenuw in de rat77,78verder ondersteunt.
Ongetwijfeld, knaagdieren zijn de proefdieren meest gebruikt in het rijk van perifere zenuw reparatie48,79. Zoals getoond, de rat MN is een handig model van perifere zenuwletsel en reparatie. In feite zijn er meerdere gestandaardiseerde strategieën beschikbaar om motorisch en zintuiglijk herstel te beoordelen, waardoor een gemakkelijkere vergelijking van de resultaten36,46,60,80,81,82. Veel van deze methoden zijn niet-invasief, waardoor dagelijkse beoordeling mogelijk is.
Bovendien maakt fysiotherapie deel uit van de standaard van zorg voor patiënten die herstellen van perifere zenuwletsels. Zoals aangetoond in dit document, zijn er meerdere strategieën om een postoperatieve fysiotherapie-achtige omgeving te bieden aan ratten die aan MN verwondingen4,5. Dit model is dan ook bijzonder geschikt om het klinische scenario te repliceren, waardoor de extrapolatie van de resultaten aan de menselijke soort12,27,48,56,58,83wordt vergemakkelijkt .
Zoals blijkt uit dit document, meerdere gestandaardiseerde strategieën zijn beschikbaar om motorisch en sensorisch herstel te beoordelen in het MN-model van de rat. De meeste daarvan zijn niet-invasieve procedures, waardoor frequente beoordeling mogelijk is. Bovendien, als de meeste perifere zenuwlaesies bij de menselijke soort optreden in de bovenste ledemaat, de genoemde experimentele fysiotherapie instellingen kunnen meer aptly herstel na te bootsen in de klinische context. Ongetwijfeld kan dit extrapolatie van de resultaten aan de menselijke soort vergemakkelijken, waardoor het gebruik van deze zenuw in de rat verder wordt geëerpoliseerd.
The authors have nothing to disclose.
Diogo Casal ontving een subsidie van The Program for Advanced Medical Education, dat wordt gesponsord door Fundação Calouste Gulbenkian, Fundação Champalimaud, Ministério da Saúde e Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal. De auteurs zijn de heer Filipe Franco zeer dankbaar voor de illustratieve tekening in figuur 1. De auteurs willen de technische hulp van de heer Alberto Severino bedanken bij het filmen en bewerken van de video. Tot slot willen de auteurs mevrouw Sara Marques bedanken voor haar hulp bij alle logistieke aspecten van de aankoop en het onderhoud van dieren.
Acetaminophen | Amazon | https://www.amazon.com/Childrens-Tylenol-grape-flavor-ages/dp/B0051VVVZG | |
Acland clamps | Fine Science Tools | 00398 V | http://www.merciansurgical.com/aclandclamps.pdf |
Acland Single Clamps B-1V (Pair) | Fine Science Tools | 396 | http://www.merciansurgical.com |
Biogel Surgical Gloves | Medex Supply | 30465 | https://www.medexsupply.com |
BSL Analysis | BIOPAC Systems | https://www.biopac.com/ | |
Castroviejo needle holders | Fine Science Tools | 12565-14 | http://s-and-t.ne |
Clamp applicator | Fine Science Tools | CAF-4 | http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf |
Constante voltage stimulator | BIOPAC Systems | STM200 | https://www.biopac.com/product/constant-voltage-stimulator-unipolar-pulse/ |
Cutasept skin disinfectant | Bode Chemie | http://www.productcatalogue.bode-chemie.com/products/skin/cutasept_f.php | |
Dafilon 10-0 | G1118099 | http://www.bbraun.com/cps/rde/xchg/bbraun-com/hs.xsl/products.html?prid=PRID00000816 | |
Derf Needle Holders 12 cm TC | Fine Science Tools | 703DE12 | http://www.merciansurgical.com |
Dry heat sterilizer | Quirumed | 2432 | http://www.quirumed.com/pt/material-de-esterilizac-o/esterilizadores |
Dynamometer | SAUTER | FH5 | https://www.sauter.eu/shop/en/measuring-instruments/force-measurement/FH-S/ |
Electroneuromiography setup | BIOPAC Systems | MP36 | https://www.biopac.com/product/biopac-student-lab-basic-systems/ |
Ethilon 5-0 | W1618 | http://www.farlamedical.co.uk/ | |
FLIR Software | FLIR | ||
Graeffe forceps 0.8 mm tips curved | Fine Science Tools | 11052-10 | http://www.finescience.de |
Graph paper | Ambar | ||
Heat Lamp HL-1 | Harvard Apparatus | 727562 | https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613 |
Heparin Sodium Solution (Heparin LEO 10000IU/ml) | Universal Drugstore | http://www.universaldrugstore.com/medications/Heparin+LEO/10000IU%2Fml | |
High-Temperature Cautery | Fine Science Tools | AA03 | http://www.boviemedical.com/products_aaroncauteries_high.asp |
Homeothermic Blanket System with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507220F | https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613 |
Infrared camera | FLIR | E6 | http://www.flir.eu/instruments/e6-wifi/ |
Instrapac – Adson Toothed Forceps (Extra Fine) | Fine Science Tools | 7973 | http://www.millermedicalsupplies.com |
Iris Scissors 11.5 cm Curves EASY-CUT | Fine Science Tools | EA7613-11 | http://www.merciansurgical.com |
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution | Sigma- Aldrich | K113 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/k113?lang=pt®ion=PT |
Lacri-lube Eye Ointment 5g | Express Chemist | LAC101F | http://www.expresschemist.co.uk/lacri-lube-eye-ointment-5g.html |
Mayo Scissors 14 cm Straight Chamfered Blades EASY-CUT | Fine Science Tools | EA7652-14 | http://www.merciansurgical.com |
Meloxicam | Recropharma | Mobic | https://www.recropharma.com/product-pipeline/meloxicam |
Methylene Blue solution | Sigma- Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product | |
Micro Jewellers Forceps 11 cm straight 00108 | Fine Science Tools | JF-5 | http://www.merciansurgical.com |
Micro Jewellers Forceps 11cm angulated 00109 | Fine Science Tools | JFA-5b | http://www.merciansurgical.com |
Micro retractor | Fine Science Tools | RS-6540 | http://www.finescience.de |
Micro Scissors Round Handles 15 cm Straight | Fine Science Tools | 67 | http://www.merciansurgical.com |
Micro-vessel dilators 11 cm 0.3 mm tips 00124 | Fine Science Tools | D-5a.2 | http://www.merciansurgical.com |
Monosyn 5-0 | 15423BR | http://www.mcfarlanemedical.com.au/15423BR/SUTURE-MONOSYN-5_or_0-16MM-70CM-(C0023423)-BOX_or_36/pd.php | |
Normal saline for irrigation | Hospira, Inc. | 0409-6138-22 | http://www.hospira.com/en/search?q=sodium+chloride+irrigation%2C+usp&fq=contentType%3AProducts |
Operating microscope | Leica Surgical Microsystems | http://www.leica-microsystems.com/products/surgical-microscopes/ | |
Skin Skribe Surgical Skin Marker | Moore Medical | 31456 | https://www.mooremedical.com/index.cfm?/Skin-Skribe-Surgical-Skin-Marker/&PG=CTL&CS=HOM&FN=ProductDetail&PID=1740&spx=1 |
Snacks | Versele-Laga | Complete Crock-Berry | http://www.versele-laga.com/en/complete/products/complete-crock-berry |
Straight mosquito forcep | Fine Science Tools | 91308-12 | http://www.finescience.de |
Surgical drapes | Barrier | 800430 | http://www.molnlycke.com/surgical-drapes/ |
Veet Sensitive Skin Hair Removal Cream Aloe Vera and Vitamin E 100 ml | Veet | http://www.veet.co.uk/products/creams/creams/veet-hair-removal-cream-sensitive-skin/ |