Presentato è un protocollo per produrre diversi tipi di lesioni nervose mediane (MN) e la riparazione nel ratto. Inoltre, il protocollo mostra come valutare il recupero funzionale del nervo utilizzando diversi test comportamentali non invasivi e misurazioni fisiologiche.
L’obiettivo principale di questa indagine è quello di mostrare come creare e riparare diversi tipi di lesioni nervose mediane (MN) nel ratto. Inoltre, vengono presentati diversi metodi per simulare la fisioterapia postoperatoria. Molteplici strategie standardizzate vengono utilizzate per valutare il recupero motorio e sensoriale utilizzando un modello MN di lesione e riparazione del nervo periferico, consentendo così un facile confronto dei risultati. Diverse opzioni sono incluse per fornire un ambiente simile alla fisioterapia postoperatoria ai ratti che hanno subito lesioni da MN. Infine, la carta fornisce un metodo per valutare il recupero del MN utilizzando diversi test non invasivi (ad esempio, test di presa, test del pungiglione, test del deflusso della scala, test di arrampicata su fune e analisi della pista a piedi), e misurazioni fisiologiche (termografia a infrarossi, elettroeuromiografia, valutazione della forza di flessione e determinazione del peso muscolare del carpire radiale). Di conseguenza, questo modello sembra particolarmente appropriato per replicare uno scenario clinico, facilitando l’estrapolazione dei risultati alla specie umana.
Anche se il nervo sciatico è il nervo più studiato nella ricerca del nervo periferico, l’analisi del ratto MN presenta vari vantaggi. Ad esempio, vi è una minore incidenza di contratture articolari e di automutilazione dell’arto interessato negli studi sulla lesione MN. Inoltre, il MN non è coperto da masse muscolari, rendendo la sua dissezione più facile di quella del nervo sciatico. Inoltre, il recupero di MN è osservato prima, perché il MN è più corto del nervo sciatico. Inoltre, il MN ha un percorso parallelo al nervo ulnare nel braccio. Quindi, il nervo ulnare può essere facilmente utilizzato come innesto nervoso per riparare le lesioni da MN. Infine, il MN nei ratti si trova nell’arto anteriore, simile all’arto superiore umano; negli esseri umani, l’arto superiore è il sito della maggior parte delle lesioni nervose periferiche.
Le lesioni nervose periferiche si verificano regolarmente a seguito di traumi, infezioni, vasculite, autoimmunità, malignità e/o radioterapia1,2. Purtroppo, la riparazione del nervo periferico continua a presentare risultati clinicamente imprevedibili e spesso deludenti3,4. È ampiamente concorso il consenso sulla necessità di una notevole ricerca di base e traslazionale per migliorare la prospettiva delle persone colpite4,5,6,7.
Il ratto MN mostra grandi somiglianze con quella degli esseri umani8,9 ( Figura1). Originario del plesso brachiale nella regione ascellare, questo nervo scende nell’aspetto mediale del braccio, raggiungendo il gomito e ramificandosi verso la maggior parte dei muscoli nel compartimento ventrale dell’avambraccio. Il MN raggiunge la mano, dove innerva i muscoli thenar e i primi due muscoli lumcali, nonché a parte della pelle della mano del ratto9 (Figura 1).
Utilizzando il ratto MN, è possibile replicare adeguatamente le lesioni nervose periferiche in esseri umani10,11,12. Questo nervo ha diversi potenziali vantaggi di ricerca rispetto al nervo sciatico abitualmente usato. Poiché il MN si trova nell’arti anteriori dei ratti (simile agli arti superiori umani), può essere danneggiato sperimentalmente con un impatto molto minore sul benessere del ratto, rispetto al nervo sciatico, che innerva una parte sostanziale dell’arto pelvico13. Inoltre, negli esseri umani la maggior parte delle lesioni cliniche si verificanellione superiore, che corrisponde all’arto anteriore del ratto10,11,12,14,15,16.
Questo documento mostra come produrre diversi tipi di lesioni MN nel ratto. Inoltre, vengono presentati diversi modi per simulare la fisioterapia postoperatoria. Infine, vengono descritti i test per valutare il ripristino funzionale del MN. Sono disponibili diverse strategie standardizzate per valutare il recupero motorio e sensoriale utilizzando un modello MN di lesione e riparazione del nervo periferico, consentendo così un facile confronto dei risultati. Il modello MN è particolarmente adatto per replicare lo scenario clinico, facilitando l’estrapolazione dei risultati alla specie umana.
Questo documento presenta un protocollo per creare diversi tipi di lesioni MN e riparare nel ratto. Inoltre, illustra come valutare il recupero funzionale di questo nervo utilizzando diversi test comportamentali non invasivi e misurazioni fisiologiche.
In particolare, molti dei test funzionali descritti in questo documento, vale a dire il Ladder Running Test e il Rope Test, dipendono in modo significativo dalla volontà del ratto di svolgere il compito con l’aspettativa di ottenere la ricompensa alimentare51,52,53. Va notato che alcuni ceppi di ratto sono più suscettibili all’allenamento e l’esecuzione riproduciva in questo tipo di test51,52,53. Ad esempio, i ratti Lewis si comportano male in questi test sia in fase di allenamento che successivamente51,52,53.
L’alloggiamento dei ratti dovrebbe consentire un’ampia libertà di movimento in accordo con il loro naturale comportamento esplorativo, oltre a consentire agli animali sperimentali di familiarizzare con alcuni degli elementi presenti nei test funzionali19. Pertanto, vengono mostrate diverse forme di alloggiamento che consentono una maggiore libertà di movimento. Le grandi gabbie sono personalizzate con elementi di arricchimento che vengono successivamente utilizzati nei test funzionali (ad esempio, corde e scale).
Probabilmente, questi elementi arricchenti così come le gabbie con ruote da corsa incorporate e le singole sfere di allenamento forniscono una forma di fisioterapia postoperatoria simile a quella offerta ai pazienti umani operati sul sistema nervoso periferico10.
Significativamente, anche se alcuni autori sostengono sezionare i tessuti sottocutanei e fasciatura muscolare senza mezzi termini o da taglio pulito con un numero 15 bisturi, l’uso di termocauterio quando si sezionano queste strutture è raccomandato per ridurre al minimo il rischio di ematoma postoperatorio.
Va notato che numerosi test sono stati ideati per testare diversi aspetti della riparazione del nervo periferico nel ratto, vale a dire la rigenerazione assonale, la reinnervazione del bersaglio e il recupero funzionale, alcuni dei quali esulano dall’ambito di questo studio29,54,55,56. Ad esempio, l’analisi cinematica29,36,55 e la valutazione itomorfometrica29,36,57 sono ampiamente impiegati da più autori. Inoltre, molti di questi test comportano variazioni per massimizzare l’efficienza e/o la riproducibilità54. Ad esempio, l’algisemetria meccanica (cioè la valutazione delle risposte agli stimoli meccanici dolorosi) può essere valutata qualitativamente utilizzando un dato filamento von Frey, come descritto nel presente documento, o semiquantitativamente utilizzando filamenti di von Frey successivi, o anche quantitativamente utilizzando dispositivi elettronici che applicano pressioni crescenti fino a quando non viene osservata una risposta di ritiro fino a quando non viene osservata una risposta di ritiro30,54.
Allo stesso modo, anche se diversi autori usano l’analisi della pista a piedi per valutare la riparazione del nervo anteriore nel ratto, altri autori sostengono che le singole lesioni MN spesso non riescono a produrre cambiamenti riproducibili nei pawprint10,58,59. Inoltre, alcuni hanno dichiarato che questi cambiamenti non possono essere proporzionali al recupero muscolare10,60. Tenendo questo in mente, alcuni ricercatori hanno sostenuto l’uso di a piedi analisi pista nella preda principalmente quando si valuta il recupero dopo la frantumazione lesioni neve piuttosto che dopo la ricostruzione del nervo segmentale10,50,61.
Il test di presa è ampiamente utilizzato per valutare il recupero motorio dei muscoli controllati dal MN16,27. Per garantire uniformità e riproducibilità dei dati ottenuti con questo test, si raccomanda l’applicazione del test di presa utilizzando la metodologia consolidata proposta da Bertelli et al.16. Tuttavia, il protocollo attuale differisce in quanto non immobilizza regolarmente la zampa contralaterale per evitare indebito stress11,27. Va anche notato che altri autori, dopo aver immobilizzato la zampa illesa, valutano quantitativamente il test di grasping utilizzando un dinamometro o una scala27,56. Tuttavia, questa valutazione quantitativa può essere influenzata dalla forza che il ricercatore applica alla coda del ratto26. Inoltre, è difficile distinguere tra la forza generata dai muscoli digital flexor (esclusivamente innervati dal MN nel ratto e l’oggetto del Grasping Test9) dalla forza prodotta dai flessori del polso, che includono il flessore carpi ulnaris che riceve la sua innervazione dal nervo ulnare9,10,27. Per cercare di eludere questi potenziali pregiudizi, questo protocollo utilizza una scala ordinale simile alla scala del Consiglio di Ricerca Medica comunemente utilizzata per classificare la forza muscolare in esseri umani10,11,62. In alternativa, altri autori hanno descritto una valutazione dettagliata della presa utilizzando l’analisi video e un sistema di punteggio basato su video11,63.
Un potenziale svantaggio dell’uso del MN rispetto al nervo sciatico è che una maggiore quantità di informazioni è disponibile per quanto riguarda quest’ultimo nervo. Questo, a sua volta, può fare un confronto dei dati ottenuti con il MN con quello delle opere sperimentali precedenti più difficili46,48,64. Inoltre, la dimensione più piccola del MN rispetto al nervo sciatico rende la manipolazione chirurgica più impegnativa8,12,27,56,65.
Contrariamente alla metodologia descritta in questo documento, la valutazione dell’elettroeuromiografia può essere eseguita utilizzando elettrodi monopolari transcutanei posizionati nel braccio e nelle regioni del campo di guida51. Nonostante sia meno invasivo, questo metodo comporta il rischio di potenziale confusione a causa della possibilità di costimolazione del nervo ulnare nella regione del braccio9,51.
La maggior parte degli autori concordano sul fatto che non tutti i test utilizzati nel ratto forniscono risultati concordanti, poiché la riparazione del nervo periferico dipende da una complessa serie di fattori, che comprendono la sopravvivenza dei neuroni, l’allungamento e la potatura assonale, la sinaptogenesi, la riconquista di successo degli organi sensoriali e delle unità motorie denervated e la plasticità cerebrale7,10,50,66,67.
Infine, va notato che un avvertimento significativo dei modelli di roditori è che i nervi periferici del ratto sono molto più vicini ai loro organi finali e hanno aree trasversali molto più piccole rispetto alle strutture umane omologhe. Tuttavia, questa differenza di dimensioni garantisce dati sperimentali più veloci nei roditori e migliori risultati complessivi nei ratti rispetto agli esseri umani sono da aspettarsi68. Infatti, diversi autori avvertono che è necessario prestare attenzione quando si cerca di estrapolare dati sperimentali ottenuti nella riparazione del nervo periferico utilizzando roditori per gli esseri umani7,69. I modelli Primate sono considerati70più comparabili. Tuttavia, il loro uso è associato a vincoli etici, logistici e di bilancio71.
Anche se il nervo sciatico è il nervo più comunemente usato nella ricerca sul nervo periferico, il ratto MN presenta molteplici vantaggi. Ad esempio, le lesioni MN sono associate a una minore incidenza di contratture congiunte e all’automutilazione della zampa interessata11,12,16,56. Significativamente, l’autotomia successiva alla transezione del nervo sciatico affligge l’11-70% dei ratti. Ciò potrebbe rendere impossibili le valutazioni attuali come l’indice sciatico14. Questo, a sua volta, rende ingombrante la stima del numero di animali necessari per ottenere un determinato potere statistico15.
Inoltre, poiché il MN è più corto del nervo sciatico, il recupero del nervo si osserva prima58,72,73,74,75,76. Inoltre, il MN non è coperto da masse muscolari, rendendo la sua dissezione tecnicamente più facile di quella del nervo sciatico16. Inoltre, il MN ha un percorso parallelo al nervo ulnare nel braccio. Quindi, il nervo ulnare può essere facilmente utilizzato come innesto nervoso per riparare le lesioni da MN. Infine, negli esseri umani, la maggior parte delle lesioni nervose periferiche si verificano nell’arto superiore, che supporta ulteriormente l’uso di questo nervo nel ratto77,78.
Probabilmente, i roditori sono gli animali sperimentali più comunemente utilizzati nel regno della riparazione del nervo periferico48,79. Come mostrato, il ratto MN è un modello conveniente di lesione e riparazione del nervo periferico. Infatti, ci sono molteplici strategie standardizzate disponibili per valutare il recupero motorio e sensoriale, permettendo un confronto più facile dei risultati36,46,60,80,81,82. Molti di questi metodi non sono invasivi, consentendo una valutazione giornaliera.
Inoltre, la fisioterapia fa parte dello standard di cura dei pazienti che si riprendono da lesioni nervose periferiche. Come dimostrato in questo documento, ci sono diverse strategie per fornire un ambiente postoperatorio simile alla fisioterapia ai ratti sottoposti a lesioni MN4,5. Quindi, questo modello è particolarmente adatto a replicare lo scenario clinico, facilitando l’estrapolazione dei risultati alla specie umana12,27,48,56,58,83.
Come mostrato in questo documento, sono disponibili più strategie standardizzate per valutare il recupero motorio e sensoriale nel modello MN del ratto. La maggior parte di queste sono procedure non invasive, consentendo una valutazione frequente. Inoltre, poiché la maggior parte delle lesioni nervose periferiche nella specie umana si verificano nell’arto superiore, le impostazioni di fisioterapia sperimentale menzionate possono imitare in modo più appropriato il recupero nel contesto clinico. Probabilmente, questo può facilitare l’estrapolazione dei risultati alla specie umana, convalidando ulteriormente l’uso di questo nervo nel ratto.
The authors have nothing to disclose.
Diogo Casal ha ricevuto una sovvenzione dal Programma per l’Educazione Medica Avanzata, che è sponsorizzato da Pitào Calouste Gulbenkian, Fundao Champalimaud, Ministério da Saàde e Fundao para a Cioncia e Tecnologia, Portogallo. Gli autori sono molto grati al sig. Figure 1 Gli autori desiderano ringraziare l’aiuto tecnico del signor Alberto Severino nelle riprese e nel montaggio del video. Infine, gli autori desiderano ringraziare la signora Sara Marques per il suo aiuto in tutti gli aspetti logistici relativi all’acquisizione e alla manutenzione degli animali.
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