Количественная подклеточная убиквитин-протеасомная активность в мозге грызунов

Система убиквитин-протеасомы (UPS) представляет собой сложную сеть взаимосвязанных белковых структур илигазов, которая контролирует деградацию большинства недолговечных белков в клетках 1. В этой системе, белки помечены для деградации или других клеточных процессов / судьбы небольшой модификатор убиквитин. Целевой белок может приобрести 1-7 модификаций убиквитина, которые могут соединяться на одном из семи лизиновых (K) участков (K6, K11, K27, K29, K33, K48 и K63) или N-терминалметионина (M1; как известно, линейный) в предыдущем ubiquitin². Некоторые из этих полиубиквитина теги деградации конкретных (K48)³, в то время как другие в значительной степени независимы от процесса деградации белка (M1)^4,5,6. Таким образом, процесс убликвитирования белка невероятно сложен, и способность к количественной оценке изменений в определенном теге полиубиквитин имеет решающее значение для понимания роли данной модификации в клеточной работе. Дальнейшее осложняет изучение этой системы, протеасома, который является каталитической структурой UPS⁷, как ухудшает белки, но также может быть вовлечен в другие непротеолитические процессы^8,9. Не удивительно, что с момента своего первого открытия, нормальная и аномачная убиквитин-протеасомная активность была вовлечена в долгосрочное формирование памяти и различные состояния заболеваний, в том числе многие неврологические, нейродегенеративные и психиатрические расстройства^10,11. В результате, методы, которые могут эффективно и эффективно количественно UPS деятельности в головном мозге имеют решающее значение для в конечном итоге понимание того, как эта система дисрегулируется в состоянии болезни и в конечном итоге разработка вариантов лечения ориентации убиквитин и / или протеасомы функционирования.

Существует ряд проблем в количественной оценке убиквитина-протеасомы активности в тканях мозга от крыс и мышей, которые являются наиболее распространенными модельными системами, используемыми для изучения функции ИБП, в ключая 1) разнообразие модификаций убиквитина, и 2) распределение и 2) дифференциальная регуляция ИПС, функционирующих между субклеточными отсеками^12,13,14. Например, многие из ранних демонстраций убиквитина-протеасомы функции в головном мозге во время формирования памяти использовали целые клеточные лисаты и указали на временное увеличение как убиквитинации белка, так и протеасомной активности^{15, 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20}. Однако, однако, мы недавно обнаружили, что убликвитин-протеасом активность сильно различается по субклеточным отсекам в ответ на обучение, с одновременным увеличением в некоторых регионах и уменьшается в других, картина, которая значительно отличается от того, что ранее сообщалось в целых клеточных лисатов²¹. Это согласуется с ограничением целого клеточного подхода, поскольку он не может разъединять вклад изменений в активность ИПС в различных субклеточных отсеках. Хотя более поздние исследования использовали синаптические протоколы фракции для изучения ИПС специально в синапсах в ответ на обучение^22,23,24, методы, используемые окклюзии способность измерять ядерные и цитоплазмические убиквитин-протеаомы изменения в том же животном. Это приводит к ненужной необходимости повторять эксперименты несколько раз, собирая различные субклеточные фракции в каждом. Это не только приводит к большей гибели животных, но и устраняет возможность непосредственно сравнивать активность ИБП в различных субклеточных отсеках в ответ на данное событие или во время определенного состояния заболевания. Учитывая, что белковые мишени убиквитина и протеамы сильно различаются по всей клетке, понимание того, как дибиквитин-протеасомы сигнализации отличается в различных субклеточных отсеков имеет решающее значение для определения функциональной роли ИБП в мозга при формировании памяти и неврологических, нейродегенеративных и психических расстройств.

Для решения этой потребности, мы недавно разработали процедуру, в которой ядерные, цитоплазмические и синаптические фракции могут быть собраны для данной области мозга от того же животного²¹. Кроме того, для учета ограниченного количества белка, который может быть получен от сбора нескольких субклеточных фракций из одного и того же образца, мы оптимизировали ранее установленные протоколы, чтобы прозаизировать активность протеасомы in vitro и специфическую связь убиквитинация белка в лисизированных клетках, собранных из ткани мозга грызунов. Используя этот протокол, мы смогли собрать и напрямую сравнить обучающие-зависимые изменения в протеасомой активности, K48, K63, M1 и общих уровнях полиубиквитина в ядре и цитоплазме и на синапсах в боковой миндалине крыс. Здесь мы подробно описываем нашу процедуру (Рисунок1),которая может значительно улучшить наше понимание того, как ИБП участвует в формировании долгосрочной памяти и различных состояниях заболеваний. Тем не менее, следует отметить, что протеасомная активность in vitro, обсуждаемая в нашем протоколе, хотя и широко используется, не измеряет непосредственно активность полных 26S протеасомы комплексов. Скорее, этот ассс измеряет активность ядра 20S, то есть он может служить только в качестве прокси, чтобы понять деятельность самого ядра, в отличие от всего 26S протеасомы комплекса.