Cuantificación de la actividad ubiquitina-proteosoma subcelular en el cerebro de los roedores

El sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) es una compleja red de estructuras y ligasas de proteínas interconectadas que controla la degradación de la mayoría de las proteínas de corta duración en las células¹. En este sistema, las proteínas se marcan para la degradación u otros procesos/fates celulares por el pequeño modificador ubiquitina. Una proteína diana puede adquirir 1-7 modificaciones de ubiquitina, que pueden unirse en uno de los siete sitios de lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48y K63) o la N-terminal metionina (M1; como se conoce como lineal) en la ubiquitina 2 anterior. Algunas de estas etiquetas de poliubiquitina son específicas de la degradación (K48)³, mientras que otras son en gran parte independientes del proceso de degradación de proteínas (M1)^4,5,6. Por lo tanto, el proceso de ubiquitinación de proteínas es increíblemente complejo y la capacidad de cuantificar los cambios en una etiqueta de poliubiquitina específica es fundamental para entender en última instancia el papel de esa modificación dada en el funcionamiento celular. Complicando aún más el estudio de este sistema, el proteosoma,que es la estructura catalítica del SAI 7, ambos degradan las proteínas pero también pueden participar en otros procesos no proteolíticos^8,9. No es de extrañar entonces, desde su descubrimiento inicial, la actividad ubiquitina-proteasoma normal y aberrante se ha implicado en la formación de la memoria a largo plazo y una variedad de estados de la enfermedad, incluyendo muchos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos trastornos^10,11. Como resultado, los métodos que pueden cuantificar de manera efectiva y eficiente la actividad del SAI en el cerebro son fundamentales para entender en última instancia cómo se desreglamenta este sistema en los estados de la enfermedad y el desarrollo final de opciones de tratamiento dirigidas a la ubiquitina y/o proteosoma.

Hay una serie de problemas en la cuantificación de la actividad ubiquitina-proteasoma en el tejido cerebral de ratas y ratones, que son los sistemas modelo más comunes utilizados para estudiar la función del SAI, incluyendo 1) la diversidad de modificaciones de ubiquitina, y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) la distribución y 2) y regulación diferencial del funcionamiento del SAI en los compartimentos subcelulares^12,13,14. Por ejemplo, muchas de las primeras demostraciones de la función ubiquitina-proteasoma en el cerebro durante la formación de la memoria utilizaron lisatos de células enteras e indicaron aumentos dependientes del tiempo tanto en la ubiquitinación de proteínas como en la actividad de proteasoma^{15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20}. Sin embargo, recientemente encontramos que la actividad ubiquitina-proteasoma varió ampliamente entre los compartimentos subcelulares en respuesta al aprendizaje, con aumentos simultáneos en algunas regiones y disminuciones en otras, un patrón que difiere significativamente de lo que se informó anteriormente en las lisades de células enteras²¹. Esto es consistente con la limitación de un enfoque de células enteras, ya que no puede disociar la contribución de los cambios en la actividad de UPS en diferentes compartimentos subcelulares. Aunque estudios más recientes han empleado protocolos de fracción sináptica para estudiar el SAI específicamente en sinapsis en respuesta al aprendizaje^22,23,24, los métodos utilizados ocluy la capacidad de medir nuclear y citoplasma ubiquitina-proteosoma cambios en el mismo animal. Esto resulta en una necesidad innecesaria de repetir experimentos varias veces, recopilando una fracción subcelular diferente en cada uno. Esto no sólo resulta en una mayor pérdida de vidas de animales, sino que elimina la capacidad de comparar directamente la actividad de UPS en diferentes compartimentos subcelulares en respuesta a un evento dado o durante un estado específico de la enfermedad. Teniendo en cuenta que las dianas proteicas de la ubiquitina y el proteosoma varían ampliamente a lo largo de la célula, entender cómo la señalización ubiquitina-proteosoma difiere en distintos compartimentos subcelulares es fundamental para identificar el papel funcional del SAI en el SAI cerebro durante la formación de la memoria y trastornos neurológicos, neurodegenerativos y psiquiátricos.

Para hacer frente a esta necesidad, hemos desarrollado recientemente un procedimiento en el que se podrían recolectar fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas para una región cerebral determinada del mismo animal²¹. Además, para tener en cuenta la cantidad limitada de proteína que se puede obtener de la recolección de múltiples fracciones subcelulares de la misma muestra, optimizamos protocolos previamente establecidos para analizar la actividad de proteasoma in vitro y la actividad específica de la vinculación ubiquitinación de proteínas en células lysed recogidas del tejido cerebral de roedores. Usando este protocolo, pudimos recopilar y comparar directamente los cambios dependientes del aprendizaje en la actividad del proteasoma, K48, K63, M1 y los niveles generales de poliubiquitinación de proteínas en el núcleo y el citoplasma y en las sinapsis en la amígdala lateral de ratas. Aquí, describimos en detalle nuestro procedimiento (Figura1), que podría mejorar significativamente nuestra comprensión de cómo el SAI está involucrado en la formación de la memoria a largo plazo y varios estados de la enfermedad. Sin embargo, cabe señalar que la actividad de proteasoma in vitro discutida en nuestro protocolo, aunque ampliamente utilizado, no mide directamente la actividad de los complejos completos de proteasoma 26S. Más bien, este ensayo mide la actividad del núcleo 20S, lo que significa que sólo puede servir como un apoderado para entender la actividad del núcleo en sí en lugar de todo el complejo de proteasoma 26S.