Quantificare l'attività subcellulare ubiquitina-proteasoma nel cervello del roditore

Il sistema onniquitina-proteasoso (UPS) è una complessa rete di strutture proteiche e legamenti interconnessi che controlla la degradazione della maggior parte delle proteine di breve durata nelle cellule¹. In questo sistema, le proteine sono contrassegnate per la degradazione o altri processi cellulari / destini dal piccolo modificatore ubiquitin. Una proteina bersaglio può acquisire 1-7 modifiche dell’ubiquitina, che possono collegarsi in uno dei sette siti di lisina (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 e K63) o la methionina N-terminale (M1; come noto come lineare) nella precedente ubiquitina². Alcuni di questi tag di poliubiquitina sono specifici per degradazione (K48)³, mentre altri sono in gran parte indipendenti dal processo di degradazione delle proteine (M1)^4,5,6. Pertanto, il processo di ubiquitinazione delle proteine è incredibilmente complesso e la capacità di quantificare i cambiamenti in un tag poliubiquitin specifico è fondamentale per comprendere in ultima analisi il ruolo di quella data modifica nel funzionamento cellulare. Complicando ulteriormente lo studio di questo sistema, il proteasome, cheè la struttura catalitica dell’UPS 7, degrada le proteine ma può anche essere coinvolto in altri processi non proteolitici^8,9. Non sorprende quindi, dalla sua scoperta iniziale, l’attività ubiquitina-proteasosa normale e aberrante è stata implicata nella formazione della memoria a lungo termine e in una varietà di stati di malattia, tra cui molti disturbi^10,11. Di conseguenza, i metodi in grado di quantificare in modo efficace ed efficiente l’attività dell’UPS nel cervello sono fondamentali per comprendere in ultima analisi come questo sistema è disregolato negli stati di malattia e l’eventuale sviluppo di opzioni di trattamento rivolte all’ubiquitina e/o funzionamento proteasome.

Ci sono una serie di problemi nella quantificazione dell’attività di ubiquitina-proteasososo nel tessuto cerebrale da ratti e topi, che sono i sistemi modello più comuni utilizzati per studiare la funzione UPS, tra cui 1) la diversità delle modifiche dell’ubiquitina, e 2) distribuzione e regolazione differenziale dell’UPS funzionante attraverso scomparti subcellulari^12,13,14. Per esempio, molte delle prime dimostrazioni della funzione ubiquitina-proteasosomico nel cervello durante la formazione della memoria utilizzato lisato intere cellule e indicato aumenti dipendenti dal tempo in entrambi l’ubiquitinazione delle proteine e l’attività proteasomiana^{15, 16 , 17} mi lato ^{, 18} mi lato ^{, 19} del 12 ^{, 20}. Tuttavia, recentemente abbiamo scoperto che l’attività di ubiquitina-proteasososo variava ampiamente attraverso i compartimenti subcellulari in risposta all’apprendimento, con aumenti simultanei in alcune regioni e diminuzioni in altre, un modello che differiva in modo significativo da quanto descritto in precedenza in lisati interi^{cellulari 21}. Ciò è coerente con la limitazione di un approccio a tutta la cellula, in quanto non può dissociare il contributo dei cambiamenti nell’attività UPS in diversi compartimenti subcellulari. Anche se studi più recenti hanno impiegato protocolli di frazione sinaptica per studiare l’UPS specificamente nelle sinapsi in risposta all’apprendimento^22,23,24, i metodi utilizzati occllude la capacità di misurare cambiamenti nucleari e citoplasmaici dell’ubiquitina-proteasososo nello stesso animale. Ciò si traduce in un bisogno inutile di ripetere gli esperimenti più volte, raccogliendo una frazione subcellulare diversa in ciascuno. Questo non solo comporta una maggiore perdita di vite umane, ma elimina la capacità di confrontare direttamente l’attività UPS attraverso diversi compartimenti subcellulari in risposta a un determinato evento o durante uno stato di malattia specifico. Considerando che gli obiettivi proteici dell’ubiquitina e del proteasoso variano ampiamente in tutta la cellula, comprendere come la segnalazione onniquitina-proteasome sia diversa nei compartimenti subcellulari distinti è fondamentale per identificare il ruolo funzionale dell’UPS neurologico durante la formazione della memoria e disturbi neurologici, neurodegenerativi e psichiatrici.

Per rispondere a questa esigenza, abbiamo recentemente sviluppato una procedura in cui le frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche potrebbero essere raccolte per una determinata regione cerebrale dallo stesso animale²¹. Inoltre, per tenere conto della quantità limitata di proteine che si può ottenere raccogliendo più frazioni subcellulari dallo stesso campione, abbiamo ottimizzato protocolli stabiliti in precedenza per analisi dell’attività proteasome in vitro e proteine in cellule lisci raccolte dal tessuto cerebrale del roditore. Utilizzando questo protocollo, siamo stati in grado di raccogliere e confrontare direttamente i cambiamenti dipendenti dall’apprendimento nell’attività proteasosa, K48, K63, M1 e i livelli complessivi di poliubiquitinazione proteica nel nucleo e nel citoplasma e nelle sinapsi nell’amigdala laterale dei ratti. In questo articolo viene descritta in dettaglio la procedura (Figura 1), che potrebbe migliorare significativamente la nostra comprensione di come l’UPS è coinvolto nella formazione della memoria a lungo termine e in vari stati di malattia. Tuttavia, va notato che l’attività proteasome in vitro discussa nel nostro protocollo, anche se ampiamente utilizzata, non misura direttamente l’attività di complessi proteasome 26S completi. Piuttosto, questo saggio misura l’attività del nucleo 20S, il che significa che può servire solo come proxy per comprendere l’attività del nucleo stesso rispetto all’intero complesso proteasome 26S.