Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein komplexes Netzwerk miteinander verbundener Proteinstrukturen und Ligasen, das den Abbau der meisten kurzlebigen Proteine in Zellen¹steuert. In diesem System werden Proteine durch den kleinen Modifikator Ubiquitin für Abbau oder andere zelluläre Prozesse/Fates markiert. Ein Zielprotein kann 1-7 Ubiquitin-Modifikationen erwerben, die an einem von sieben Lysin(K)-Standorten (K6, K11, K27, K29, K33, K48 und K63) oder dem N-Terminal Methionin (M1; bekannt als linear) im vorherigen Ubiquitin²miteinander verknüpft werden können. Einige dieser Polyubiquitin-Tags sind abbauspezifisch (K48)³, während andere weitgehend unabhängig vom Proteinabbauprozess (M1)^4,5,6sind. Daher ist der Protein-Ubiquitinationsprozess unglaublich komplex und die Fähigkeit, Veränderungen in einem bestimmten Polyubiquitin-Tag zu quantifizieren, ist entscheidend für das letztendliche Verständnis der Rolle dieser gegebenen Veränderung in der zellulären Funktion. Erschwerend kommt hinzu, dass die Untersuchung dieses Systems, das Proteasom,die katalytische Struktur der USV 7, sowohl Proteine abbaut, als auch aber auch an anderen nicht-proteolytischen Prozessen beteiligt sein kann^8,9. Es überrascht nicht, dass seit seiner ersten Entdeckung eine normale und abnorme ubiquitin-proteasomische Aktivität in die Langzeitgedächtnisbildung und eine Vielzahl von Krankheitszuständen verwickelt ist, darunter viele neurologische, neurodegenerative und psychiatrische Störungen^10,11. Infolgedessen sind Methoden, die die USS-Aktivität im Gehirn effektiv und effizient quantifizieren können, entscheidend für das letztendliche Verständnis, wie dieses System in Krankheitszuständen dysreguliert ist, und die letztendliche Entwicklung von Behandlungsmöglichkeiten, die auf Ubiquitin und/oder proteasom funktionadieren.

Es gibt eine Reihe von Problemen bei der Quantifizierung der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Hirngewebe von Ratten und Mäusen, die die häufigsten Modellsysteme sind, die verwendet werden, um die UPS-Funktion zu untersuchen, einschließlich 1) die Vielfalt der Ubiquitin-Modifikationen und 2) Die Verteilung und Differenzregelung der USUs-Funktion über subzelluläre Kompartimente^12,13,14. Zum Beispiel verwendeten viele der frühen Demonstrationen der Ubiquitin-Proteasom-Funktion im Gehirn während der Gedächtnisbildung ganze Zelllysate und deuteten auf eine zeitabhängige Zunahme sowohl der Protein-Ubiquitination als auch der Proteasomenaktivität^{15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20}. Vor kurzem stellten wir jedoch fest, dass die Ubiquitin-Proteasomen-Aktivität in den subzellulären Fächern als Reaktion auf das Lernen sehr unterschiedlich war, wobei in einigen Regionen gleichzeitig zunimmt und in anderen ein Muster abnimmt, das sich erheblich unterscheidet. von dem, was zuvor in ganzen Zelllysaten berichtet wurde²¹. Dies steht im Einklang mit der Einschränkung eines gesamten Zellansatzes, da er den Beitrag von Änderungen der USB-Aktivität über verschiedene subzelluläre Kompartimente hinweg nicht trennen kann. Obwohl neuere Studien synaptische Bruchprotokolle verwendet haben, um die USV speziell an Synapsen als Reaktion auf das Lernen^22,23,24zu studieren, schließen die angewandten Methoden die Fähigkeit zur Messung kerntechnische und zytoplasmatische Ubiquitin-Proteasom-Veränderungen im selben Tier. Dies führt zu einer unnötigen Notwendigkeit, Experimente mehrmals zu wiederholen, wobei jeweils eine andere subzelluläre Fraktion gesammelt wird. Dies führt nicht nur zu einem größeren Verlust von Tierleben, sondern eliminiert auch die Möglichkeit, DIE USV-Aktivität in verschiedenen subzellulären Abteilungen als Reaktion auf ein bestimmtes Ereignis oder während eines bestimmten Krankheitszustands direkt zu vergleichen. Wenn man bedenkt, dass die Proteinziele von Ubiquitin und dem Proteasom in der Zelle sehr unterschiedlich sind, ist es entscheidend zu verstehen, wie sich die Ubiquitin-Proteasome-Signalisierung in verschiedenen subzellulären Kompartimenten unterscheidet, um die funktionelle Rolle der USB in der Gedächtnisbildung und neurologische, neurodegenerative und psychiatrische Störungen.

Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir vor kurzem ein Verfahren entwickelt, bei dem kerntechnische, zytoplasmatische und synaptische Fraktionen für eine bestimmte Hirnregion desselben Tieres gesammelt werden könnten²¹. Um die begrenzte Menge an Protein zu berücksichtigen, die aus der Entnahme mehrerer subzellulärer Fraktionen aus derselben Probe gewonnen werden kann, haben wir zuvor etablierte Protokolle optimiert, um die In-vitro-Proteasomaktivität und die linkage-spezifische Protein-Ubiquitination in lysierten Zellen aus Nagetier-Gehirngewebe gesammelt. Mit diesem Protokoll konnten wir lernabhängige Veränderungen der Proteasomaktivität K48, K63, M1 und der gesamten Proteinpolyubiquitination im Kern und Zytoplasma sowie an Synapsen in der lateralen Amygdala von Ratten sammeln und direkt vergleichen. Hier beschreiben wir detailliert unser Verfahren (Abbildung 1), das unser Verständnis davon, wie die USV an der Langzeitgedächtnisbildung und verschiedenen Krankheitszuständen beteiligt ist, erheblich verbessern könnte. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass die in unserem Protokoll diskutierte In-vitro-Proteasomaktivität zwar weit verbreitet ist, aber die Aktivität vollständiger 26S-Proteasomkomplexe nicht direkt misst. Vielmehr misst dieser Assay die Aktivität des 20S-Kerns, d. h. er kann nur als Proxy dienen, um die Aktivität des Kerns selbst im Gegensatz zum gesamten 26S-Proteasom-Komplex zu verstehen.