Quantification de l'activité subcellulaire ubiquitine-protéasome dans le cerveau des rongeurs

Le système ubiquitine-protéasome (UPS) est un réseau complexe de structures et de ligases de protéines interconnectées qui contrôle la dégradation de la plupart des protéines de courte durée dans les cellules¹. Dans ce système, les protéines sont marquées pour la dégradation ou d’autres processus cellulaires / destins par le petit modificateur ubiquitine. Une protéine cible peut acquérir 1-7 modifications d’ubiquitine, qui peuvent relier ensemble à l’un des sept sites de lysine (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 et K63) ou la méthionine N-terminale (M1; aussi connu sous le nom linéaire) dans l’ubiquitine précédente². Certaines de ces étiquettes de polyubiquitine sont spécifiques à la dégradation (K48)³, tandis que d’autres sont largement indépendantes du processus de dégradation des protéines (M1)^4,5,6. Ainsi, le processus d’ubiquitination des protéines est incroyablement complexe et la capacité de quantifier les changements dans une étiquette spécifique de polyubiquitine est essentielle pour comprendre en fin de compte le rôle de cette modification donnée dans le fonctionnement cellulaire. Compliquant encore l’étude de ce système, le protéasome, qui est la structure catalytique de l’UPS⁷, les deux dégrade ntlifient les protéines, mais peut également être impliqué dans d’autres processus non protéolytiques^8,9. Il n’est donc pas surprenant que, depuis sa découverte initiale, l’activité normale et aberrante ubiquitine-protéasome ait été impliquée dans la formation à long terme de mémoire et une série d’états de la maladie, y compris beaucoup neurologique, neurodégénérative et psychiatrique troubles^10,11. En conséquence, les méthodes qui peuvent quantifier efficacement et efficacement l’activité UPS dans le cerveau sont essentielles pour comprendre en fin de compte comment ce système est dysrégulé dans les états de la maladie et le développement éventuel d’options de traitement ciblant l’ubiquitine et / ou protéasome fonctionnement.

Il y a un certain nombre de questions dans la quantification de l’activité ubiquitine-protéasome dans les tissus cérébraux des rats et des souris, qui sont les systèmes modèles les plus communs utilisés pour étudier la fonction d’UPS, y compris 1) la diversité des modifications d’ubiquitin, et 2) la distribution et régulation différentielle du fonctionnement d’UPS entre les compartiments subcellulaires^12,13,14. Par exemple, bon nombre des premières démonstrations de la fonction ubiquitine-protéasome dans le cerveau pendant la formation de mémoire ont utilisé des lysates de cellules entières et ont indiqué des augmentations de temps-dépendantes dans l’ubiquitination de protéine et l’activité protéasome^{15, 16} Annonces ^{, 17 Annonces , 18} ans, états-unis qui ^{, 19 ans,} états-unis qui ^{, 20}. Cependant, nous avons récemment constaté que l’activité ubiquitine-protéasome variait considérablement d’un compartiment subcellulaire à l’autre en réponse à l’apprentissage, avec des augmentations simultanées dans certaines régions et des diminutions dans d’autres, un modèle qui diffère considérablement de ce qui a été précédemment rapporté dans les lysates de cellule entière²¹. Ceci est compatible avec la limitation d’une approche cellulaire entière, car elle ne peut dissocier la contribution des changements dans l’activité d’UPS dans différents compartiments subcellulaires. Bien que des études plus récentes ont utilisé des protocoles de fraction synaptique pour étudier l’UPS spécifiquement aux synapses en réponse à l’apprentissage^22,23,24, les méthodes utilisées occlude la capacité de mesurer changements ubiquitine-protéasome nucléaires et cytoplasmiques chez le même animal. Il en résulte un besoin inutile de répéter des expériences plusieurs fois, la collecte d’une fraction subcellulaire différente dans chacun. Non seulement cela entraîne une plus grande perte de vies animales, mais il élimine la capacité de comparer directement l’activité UPS à travers différents compartiments subcellulaires en réponse à un événement donné ou au cours d’un état de maladie spécifique. Considérant que les cibles protéiques de l’ubiquitine et du protéasome varient considérablement dans l’ensemble de la cellule, il est essentiel de comprendre comment la signalisation ubiquitine-protéasome diffère dans les compartiments subcellulaires distincts pour identifier le rôle fonctionnel de l’UPS dans le cerveau pendant la formation de mémoire et les désordres neurologiques, neurodégénératifs et psychiatriques.

Pour répondre à ce besoin, nous avons récemment mis au point une procédure dans laquelle des fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques pourraient être recueillies pour une région du cerveau donnée à partir du même animal²¹. En outre, pour tenir compte de la quantité limitée de protéines qui peuvent être obtenues à partir de la collecte de plusieurs fractions subcellulaires à partir d’un même échantillon, nous avons optimisé les protocoles précédemment établis pour analyser l’activité protéasome in vitro et lien spécifique l’ubiquitination de protéine dans les cellules lysed s’est rassemblée du tissu de cerveau de rongeur. En utilisant ce protocole, nous avons pu recueillir et comparer directement les changements dépendants de l’apprentissage dans l’activité protéasome, K48, K63, M1 et les niveaux globaux de polyubiquitination de protéine dans le noyau et le cytoplasme et aux synapses dans l’amygdale latérale des rats. Ici, nous décrivons en détail notre procédure ( Figure1), qui pourrait améliorer considérablement notre compréhension de la façon dont l’UPS est impliqué dans la formation de la mémoire à long terme et divers états de la maladie. Cependant, il convient de noter que l’activité protéasome in vitro discutée dans notre protocole, bien que largement utilisée, ne mesure pas directement l’activité des complexes protéasomes complets de 26S. Au contraire, cet analyse mesure l’activité du noyau 20S, ce qui signifie qu’il ne peut servir de proxy que pour comprendre l’activité du noyau lui-même par opposition à l’ensemble du complexe protéasome 26S.