Nós apresentamos técnicas para isolar-se, cultivando, caracterizando, e diferenciando pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) obtidas do tecido esqueletal da biópsia do músculo. os hmpcs obtidos e caracterizados através destes métodos podem ser usados para abordar subseqüentemente as perguntas da pesquisa relativas à miogenesis humana e à regeneração do músculo esqueletal.
O uso do tecido humano primário e das células é ideal para a investigação de processos biológicos e fisiológicos, como o processo regenerativo do músculo esquelético. Há desafios reconhecidos para trabalhar com células-tronco adultas primárias humanas, particularmente células progenitoras musculares humanas (hMPCs) derivadas de biópsias de músculo esquelético, incluindo a baixa produção de células de tecido coletado e um grande grau de heterogeneidade de doadores de parâmetros de crescimento e morte entre culturas. Ao incorporar a heterogeneidade no projeto experimental exige um tamanho de amostra maior para detectar efeitos significativos, igualmente permite que nós identifiquem os mecanismos que fundamentam a variabilidade na capacidade da expansão de hmpc, e permitem assim que nós compreendam melhor heterogeneidade na regeneração muscular esquelética. Novos mecanismos que distinguem a capacidade de expansão das culturas têm o potencial de levar ao desenvolvimento de terapias para melhorar a regeneração muscular esquelética.
O músculo esquelético é o maior sistema de órgãos do corpo humano, representando 30 − 40% da massa corporal inteira1. Além do que seu papel bem reconhecido na locomoção, o músculo esqueletal mantem a temperatura e a postura de corpo, e joga um papel central na homeostase nutriente do corpo inteiro. Pesquisas envolvendo participantes humanos, animais e modelos de cultura celular são valiosas para abordar questões relacionadas à biologia e regeneração do músculo esquelético. A isolação e a cultura de pilhas preliminares humanas do progenitor do músculo (hMPCs) fornecem um modelo robusto que permita que as técnicas e as manipulações da cultura de pilha sejam aplicadas às amostras humanas. Uma vantagem de usar hmpcs é que eles mantêm o fenótipo genético e metabólico de cada doador2,3. A manutenção do phenotype do doador permite que os investigadores examinem a variação inter-individual no processo myogenic. Por exemplo, empregamos nosso método de caracterização do hMPC para identificar diferenças relacionadas à idade e ao sexo na capacidade de expansão da população de hMPC4.
A finalidade deste protocolo é detalhar técnicas para isolar, cultura, caracterizar, e diferenciar hMPCs do tecido da biópsia do músculo esqueletal. Com base no trabalho anterior que descreveu hmpcs e identificou potenciais fabricantes de superfície celular para o isolamento de hmpc5,6, este protocolo preenche uma lacuna crítica noconhecimento, ligandoo isolamento à caracterização de hmpcs. Além disso, as instruções detalhadas passo a passo incluídas neste protocolo tornam o isolamento e a caracterização do hMPC acessíveis a um amplo público científico, incluindo aqueles com experiência prévia limitada com hMPCs. Nosso protocolo está entre os primeiros a descrever o uso de um citômetro da imagem latente para seguir populações da pilha. Os citômetros recentemente projetados da imagem latente são State-of-the-art, elevado-throughput, e microplate-baseado, permitindo a imagem latente viva da pilha, a contagem da pilha, e a análise multicanais da fluorescência de todas as pilhas em cada poço de uma embarcação da cultura dentro dos minutos. Este sistema permite a quantificação rápida de mudanças dinâmicas na proliferação e na viabilidade de uma população inteira da pilha com somente o rompimento mínimo à cultura. Por exemplo, somos capazes de realizar medidas objetivas de confluência em dias sucessivos in vitro para determinar a cinética de crescimento de cada cultura derivada de diferentes doadores. Muitos protocolos na literatura, particularmente aqueles que envolvem a diferenciação de MPCs, necessitam de células para atingir um nível definido de confluência antes de iniciar a diferenciação ou tratamento7. Nosso método permite a determinação objetiva da confluência de cada poço em um vaso de cultura, permitindo que os pesquisadores iniciem o tratamento de forma imparcial e não-subjetiva.
No passado, uma limitação principal de usar hMPCs preliminares era baixos rendimentos que limitam o número de pilhas disponíveis para experiências. Nós e outros mostraram que o rendimento de MPCs do tecido de biópsia do músculo esquelético é de 1 − 15 MPCs por miligrama de tecido (Figura 1)8. Como nosso protocolo permite quatro passagens das células antes da purificação com a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), nossos rendimentos criopreservados de hMPC, derivados de pequenas quantidades de tecido de biópsia (50 − 100 mg), são suficientes para abordar os objetivos de pesquisa onde são necessários vários experimentos. Nosso protocolo FACS produz um ~ 80% puro (Pax7 positivo) MPC população, assim, nosso protocolo é otimizado tanto para o rendimento e pureza.
Os hMPCs primários são um importante modelo de pesquisa usado para compreender a biologia do músculo esquelético e o processo regenerativo. Adicionalmente, os hMPCs têm o potencial ser usado para a terapia. Entretanto, há uns desafios reconhecidos em usar hMPCs preliminares para a pesquisa e a terapia, incluindo a compreensão limitada das pilhas derivadas dos seres humanos10. Há também um grande grau de variação na capacidade de expansão entre as culturas doadoras, o que limita o poten…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem à Universidade de Cornell, centro de recursos de biotecnologia Imaging Facility por sua ajuda com a triagem de células ativadas por fluorescência. Agradecemos também Molly Gheller por sua ajuda com o recrutamento participante e Erica Bender para a realização das biópsias de músculo esquelético. Por fim, agradecemos aos participantes pelo seu tempo e participação no estudo. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de envelhecimento dos institutos nacionais de saúde o prêmio número R01AG058630 (para B.D.C. e A.E.T.), por uma Fundação Glenn para pesquisa médica e Federação Americana para o envelhecimento Research Grant para a faculdade Júnior (para B . D.C.), e pelo Conselho do Presidente para as mulheres de Cornell (para A.E.T.).
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
Penicillin/Streptomycin 100X Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |