Изоляция, Культура, Характеристика и Дифференциация клеток-прародителей мышц человека от процедуры биопсии скелетных мышц

Скелетная мышца является крупнейшей органной системой в организме человека, накоторую приходится 30–40% массы всего тела 1. В дополнение к своей хорошо признанной роли в передвижении, скелетные мышцы поддерживает температуру тела и осанку, и играет центральную роль во всем теле питательных гомеостаза. Исследования с участием человеческих участников, животных и моделей клеточной культуры являются ценными для решения вопросов, касающихся биологии скелетных мышц и регенерации. Изоляция и культура клеток-прародителей мышц человека (HMPCs) обеспечивает надежную модель, которая позволяет использовать методы клеточной культуры и манипуляции в образцах человека. Преимущество использования HMPCs является то, что они сохраняют генетический и метаболический фенотип от каждого донора^2,3. Поддержание донорского фенотипа позволяет исследователям исследовать межиндивидуальные различия в миогенном процессе. Например, мы использовали наш метод характеристикhMPC для выявления возрастных и половыхразличий в емкости расширения популяции hMPC 4.

Цель юма этого протокола состоит в том, чтобы подробно методы изолировать, культуры, охарактеризовать и дифференцировать HMPCs от скелетной мышечной биопсии ткани. Опираясь на предыдущую работу, которая описала HMPCs и определилпотенциальных создателей поверхности клеток для изоляции hMPC^5,6, этот протокол заполняет критический пробел в знаниях, связывая изоляцию с характеристикой HMPCs. Кроме того, подробные пошаговые инструкции, включенные в этот протокол, делают изоляцию и характеристики hMPC доступными для широкой научной аудитории, в том числе с ограниченным опытом работы с ГМпС. Наш протокол является одним из первых, чтобы описать использование цитометра изображений для отслеживания популяций клеток. Недавно разработанные цитометры визуализации являются самыми современными, высокопроизводительными и микроплитными, что позволяет в течение нескольких минут анализировать живые клетки, подсчет клеток и многоканальный анализ флуоресценции всех клеток в каждой скважине сосуда культуры. Эта система позволяет быстро количественно измерять динамические изменения в пролинизации и жизнеспособности всей популяции клеток с минимальным нарушением культуры. Например, мы можем выполнять объективные показатели слияния в последующие дни в пробирке, чтобы определить кинетику роста каждой культуры, полученной от различных доноров. Многие протоколы в литературе, особенно те, с участием дифференциации ПДК, требуют клетки для достижения определенного уровня слияния до начала дифференциации или лечения⁷. Наш метод позволяет объективно определить слияние каждой скважины в сосуде культуры, что позволяет исследователям инициировать лечение беспристрастным, несубъективным образом.

В прошлом основным ограничением использования первичных ГМпС были низкие урожаи, ограничивающие количество клеток, доступных для экспериментов. Мы и другие показали, что выход ПДК из ткани биопсии скелетных мышц составляет 1–15 ПДК на миллиграмм ткани(рисунок 1)⁸. Поскольку наш протокол позволяет четыре прохода клеток до очистки с флуоресценцией активированной сортировки клеток (FACS), наши криоконсервированные урожаи hMPC, полученные из небольших количеств биопсии ткани (50-100 мг), достаточно для решения исследовательских целей, где требуется несколько экспериментов. Наш протокол FACS производит 80% чистой (Pax7 положительный) MPC населения, таким образом, наш протокол оптимизирован как для урожайности и чистоты.