Isolamento, cultura, caratterizzazione e differenziazione delle cellule del progenitore muscolare umano dalla procedura di biopsia muscolare scheletrica

Il muscolo scheletrico è il più grande sistema di organi nel corpo umano, che rappresenta il 30-40% di tutta la massa corporea¹. Oltre al suo ruolo ben riconosciuto nella locomozione, il muscolo scheletrico mantiene la temperatura corporea e la postura e svolge un ruolo centrale nell’omeostasi nutritiva di tutto il corpo. La ricerca che coinvolge partecipanti umani, animali e modelli di coltura cellulare sono tutti preziosi per affrontare le domande relative alla biologia muscolare scheletrica e alla rigenerazione. L’isolamento e la coltura delle cellule progenitrici muscolari primarie umane (hMCC) fornisce un modello robusto che consente di applicare tecniche e manipolazioni della coltura cellulare a campioni umani. Un vantaggio dell’uso di hMPC è che mantengono il fenotipo genetico e metabolico da ciascun donatore^2,3. La manutenzione del fenotipo del donatore consente ai ricercatori di esaminare la variazione inter-individuale nel processo miogenico. Ad esempio, abbiamo impiegato il nostro metodo di caratterizzazione hMPC per identificare le differenze legate all’età e al sesso nella capacità di espansione della popolazione di hMPC⁴.

Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere in dettaglio le tecniche per isolare, cultura, caratterizzare e differenziare gli HMP Dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica. Basandosi su un lavoro precedente che descriveva gli HMPC e identificava i potenziali produttori di superfici cellulari per l’isolamento hMPC^5,6, questo protocollo colma una lacuna critica nella conoscenza collegando l’isolamento alla caratterizzazione degli hMPC. Inoltre, le istruzioni dettagliate fornite in questo protocollo rendono l’isolamento e la caratterizzazione hMPC accessibili a un vasto pubblico scientifico, comprese quelle con un’esperienza precedente limitata con gli HMPC. Il nostro protocollo è tra i primi a descrivere l’uso di un citometro di imaging per tracciare le popolazioni cellulari. I citometri di imaging di nuova progettazione sono all’avanguardia, ad alta produttività e a base di microlamiche, consentendo l’imaging delle cellule vive, il conteggio delle celle e l’analisi della fluorescenza multicanale di tutte le celle in ogni pozzo di un vaso di coltura in pochi minuti. Questo sistema consente una rapida quantificazione dei cambiamenti dinamici nella proliferazione e nella vitalità di un’intera popolazione cellulare con solo una minima interruzione della cultura. Ad esempio, siamo in grado di eseguire misure oggettive di confluenza nei giorni successivi in vitro per determinare la cinetica di crescita di ogni cultura derivata da diversi donatori. Molti protocolli in letteratura, in particolare quelli che comportano la differenziazione dei MPC, richiedono alle cellule di raggiungere un livello definito di confluenza prima di iniziare la differenziazione o il trattamento⁷. Il nostro metodo consente una determinazione oggettiva della confluenza di ogni pozzo in un vaso di coltura che consente ai ricercatori di iniziare il trattamento in modo imparziale e non soggettivo.

In passato, una delle principali limitazioni dell’uso di HMPC primarie era la bassa resa che limitava il numero di cellule disponibili per gli esperimenti. Noi e altri abbiamo mostrato che la resa di MPC dal tessuto della biopsia muscolare scheletrica è di 1/15 MPC per milligrammo di tessuto (Figura 1)⁸. Poiché il nostro protocollo consente quattro passaggi delle cellule prima della purificazione con la fluorescenza activated cell sorting (FACS), le nostre rese hMPC crioconservate, derivate da piccole quantità di tessuto biopsia (50-100 mg), sono sufficienti per affrontare gli obiettivi di ricerca dove sono necessari più esperimenti. Il nostro protocollo FACS produce una popolazione MPC pura (Pax7 positiva) di 80 dollari, quindi il nostro protocollo è ottimizzato sia per la resa che per la purezza.