İskelet Kas Biyopsisi Prosedüründen İnsan Kas Atası Hücrelerinin İzolasyon, Kültür, Karakterizasyonu ve Farklılaşması
Summary
İskelet kas biyopsi sözünde nizolating, culturing, karakterizasyonu ve insan primer kas atası hücreleri (hMPCs) ayırt etme teknikleri salıyoruz. bu yöntemlerle elde edilen ve karakterize edilen hMPC’ler daha sonra insan miyogenezi ve iskelet kası rejenerasyonu ile ilgili araştırma sorularını ele almak için kullanılabilir.
Abstract
Birincil insan dokusu ve hücrelerinin kullanımı iskelet kası rejeneratif süreci gibi biyolojik ve fizyolojik süreçlerin araştırılması için idealdir. İnsan birincil yetişkin kök hücreleri ile çalışma için tanınan zorluklar vardır, özellikle insan kas progenitor hücreleri (hMPCs) iskelet kas biyopsileri elde, toplanan doku düşük hücre verimi ve donör heterojenlik büyük ölçüde de dahil olmak üzere kültürler arasında büyüme ve ölüm parametreleri. Heterojenliği deneysel tasarıma dahil etmek önemli etkileri tespit etmek için daha büyük bir örnekboyutu gerektirirken, aynı zamanda hMPC genişletme kapasitesinde değişkenliğin altında yatan mekanizmaları belirlememize olanak tanır ve böylece daha iyi anlamamızı sağlar iskelet kası rejenerasyonunda heterojenlik. Kültürlerin genişleme kapasitesini birbirinden ayıran yeni mekanizmalar iskelet kas rejenerasyonunu iyileştirmek için tedavilerin geliştirilmesine yol açma potansiyeline sahiptir.
Introduction
İskelet kası insan vücudundaki en büyük organ sistemidir ve tüm vücut kütlesinin%30−40’ını oluşturur. Hareket onun iyi tanınan rolüne ek olarak, iskelet kası vücut ısısını ve duruşunu korur, ve tüm vücut besin homeostaz merkezi bir rol oynar. İnsan katılımcılar, hayvanlar ve hücre kültürü modellerini içeren araştırmalar iskelet kas biyolojisi ve yenilenme ile ilgili soruları ele almak için değerlidir. İzolasyon ve insan birincil kas atası hücrelerinin kültürü (hMPCs) hücre kültürü teknikleri ve manipülasyonlar insan örneklerine uygulanması için izin veren sağlam bir model sağlar. HMPCs kullanmanın bir avantajı, her donör2,3genetik ve metabolik fenotip korumak olduğunu. Donör fenotipin inbakımı, araştırmacıların miyojenik süreçteki bireysel varyasyonları incelemelerine olanak tanır. Örneğin, hMPC nüfus genişleme kapasitesi4yaş ve cinsiyete bağlı farklılıkları belirlemek için hMPC karakterizasyon yöntemimizi çalıştırdık.
Bu protokolün amacı, hMPC’leri iskelet kas biyopsi dokusundan izole etme, kültür, karakterize etme ve ayırt etme tekniklerini detaylandırmaktır. HMPC’leri tanımlayan ve hMPCyalıtımıiçin potansiyel hücre yüzeyi yapıcıları tanımlayan önceki çalışmalardan oluşan 5,6, bu protokol, hMPC’lerin karakterizasyonuna izolasyon bağlayarak bilgideki kritik bir boşluğu doldurur. Ayrıca, bu protokolde yer alan ayrıntılı adım adım talimatlar, hMPC’lerle sınırlı deneyimi olanlar da dahil olmak üzere, hMPC yalıtımını ve karakterizasyonu geniş bir bilimsel hedef kitle için erişilebilir hale getirir. Protokolümüz hücre popülasyonlarını izlemek için görüntüleme sitometresi kullanımını ilk tanımlayanlardan biridir. Yeni tasarlanmış görüntüleme sitometreleri, bir kültür damarının her kuyusundaki tüm hücrelerin birkaç dakika içinde canlı hücre görüntüleme, hücre sayma ve çok kanallı floresan analizini sağlayan son teknoloji ürünü, yüksek iş sahibi ve mikroplaka tabanlıdır. Bu sistem, tüm hücre popülasyonunun çoğalması ve yaşanabilirliğindeki dinamik değişikliklerin hızlı bir şekilde ölçülmesine ve kültüre en az düzeyde zarar verebilmeye olanak sağlar. Örneğin, farklı bağışçılardan elde edilen her kültürün büyüme kinetiklerini belirlemek için, birbirini izleyen günlerde in vitro birleştiğinde objektif bir araya gelmek için objektif önlemler alabiliriz. Literatürdeki birçok protokol, özellikle MPC’lerin farklılaşmasını içeren protokoller, hücrelerin farklılaşma veya tedaviyi başlatmadan öncetanımlanmış bir kesişme düzeyine ulaşmasını gerektirir 7. Yöntemimiz, araştırmacıların tarafsız, öznel olmayan bir şekilde tedaviye başlamalarına olanak tanıyan bir kültür gemisinde her kuyunun birleşmesi objektif olarak belirlenmesine olanak sağlar.
Geçmişte, birincil hMPCs kullanarak önemli bir sınırlama deneyler için kullanılabilir hücre sayısını sınırlayan düşük verimleri oldu. Biz ve diğerleri iskelet kas biyopsi salgı dokusundan MCD verimi göstermiştir 1−15 MPCs doku miligram başına (Şekil 1)8. Protokolümüz floresan aktif hücre sıralaması (FACS) ile arınma öncesinde hücrelerin dört geçişine izin verdiği için, az miktarda biyopsi dokusundan (50−100 mg) elde edilen kriyopayrılmış hMPC verimlerimiz araştırma amaçlarını ele almak için yeterlidir. birden fazla deney gereklidir. FACS protokolümüz ~%80 saf (Pax7 pozitif) MPC popülasyonu üretir, böylece protokolümüz hem verim hem de saflık için optimize edilsin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primer hMPCs iskelet kas biyolojisi ve rejeneratif süreci anlamak için kullanılan önemli bir araştırma modelidir. Ayrıca, hMPCs tedavi için kullanılmak üzere potansiyele sahiptir. Ancak, insanlar dan elde edilen hücrelerin sınırlı anlayış da dahil olmak üzere, hem araştırma ve tedavi için birincil hMPCs kullanarak tanınan zorluklar vardır10. Ayrıca donör kültürler arasında genişleme kapasitesinde büyük ölçüde varyasyon vardır, bu da hMPC’lerin kullanım potansiyel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Floresan aktif hücre sıralama ile yardım için Cornell Üniversitesi, Biyoteknoloji Kaynak Merkezi Görüntüleme Tesisi teşekkür ederiz. Ayrıca molly Gheller’a katılımcı alımına yardımları için ve Erica Bender’a iskelet kası biyopsilerini yaptığı için teşekkür ederiz. Son olarak katılımcılara zamanları ve çalışmaya katılımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, R01AG058630 Ödül Numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Yaşlanma Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir (B.D.C. ve A.E.T.), Glenn Vakfı Tıbbi Araştırma ve Amerikan Federasyonu Tarafından Yaşlanma Araştırma Hibe junior fakülte (B için . D.C.), ve Cornell Kadınlar Için Başkan Konseyi tarafından (A.E.T.’ye).
Materials
| 0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-Cl | Trypsin used for removing adherent hMPCs from cell culture vessels |
| 10 cm cell culture plate | VWR | 664160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352196 | 15 mL conical tubes used throughout the hMPC isolation and culturing protocols |
| 24 well cell culture plate | Grenier Bio-One | 662 160 | Plates used for culturing hMPCs |
| 7-AAD Viability Staining Solution | eBioscience | 00-6993-50 | Viability stain for identifying living cells during FACS sorting |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD29, Clone: TS2/16 | BioLegend | 303016 | Conjugated antibody for FACS |
| Black 96-well cell culture plate | Grenier Bio-One | 655079 | 96-well cell culture plate ideal for fluorescent imaging using the Celigo S |
| Celigo S | Nexcelcom Bioscience | Imaging cytometer used to track hMPC cultures | |
| Cell Strainer | VWR | 352350 | Cell strainer to eliminate large pieces of debris during muscle biopsy processing |
| Collagen Type I (Rat Tail) | Corning | 354236 | Collagen for coating cell culture plates |
| Collagenase D | Roche | 11 088 882 001 | Used for degradation of collagen and other connective tissue in the skeletal muscle biopsy tissue |
| Dimethyl Sulfoxide | VWR | WN182 | Used for cryopreservation of hMPCs |
| Dispase II | Sigma Life Sciences | D4693 | A protease used for enzymatic digestion of skeletal muscle biopsy tissue |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose powder | Gibco | 31600-034 | Low glucose DMEM for muscle biopsy processing |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 21600-010 | PBS for muscle biopsy processing |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | J.T. Baker | 4040-01 | Required for FACS buffer |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 89510-186 | Fetal bovine serum used for hMPC growth media |
| Ham's F12 | Gibco | 21700-026 | Base media for hMPCs |
| Heat Inactivated Equine Serum | Gibco | 26-050-070 | Horse serum used to make hMPC differentiation media |
| Hemocytometer | iNCyto | DHC-N0105 | Used to count cells |
| Hibernate A | Gibco | A1247501 | Media for preserving skeletal muscle biopsy tissue |
| Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Life Technologies | H21492 | DNA stain for identifying all cells using the Celigo S |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P-4 | Used for controlled rate freezing of hMPCs |
| Moxi buffer | Orflo | MXA006 | Buffer for automated cell counter |
| Moxi Cassettes | Orflo | MXC002 | Cassesttes for automated cell counter |
| Moxi z Mini Automated Cell Counter | Orflo | Automated cell counter | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | Commerically available controlled rate cell freezing container |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Goat serum used in FACS buffer |
| PE-Cy7 Mouse Anti-human CD56 , Clone: B159 | BD Pharmingen | 557747 | Conjugated antibody for FACS |
| Penicillin/Streptomycin 100X Solution | Corning | 30-002-CI | Antibiotics added to culture media |
| Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | DNA stain for identifying dead cells using the Celigo S |
| Recombinant Human basic fibroblast growth factor | Promega | G5071 | Supplement in hMPC growth media to prevent spontaneous differentiation |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Gibco | 12648-010 | Media used to cryoperseve muscle biopsy slurries |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 | Added to Ham's F12 |
| Sterile Round Bottom 5 mL tubes | VWR | 60818-565 | Tubes used for FACS |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | Compensation beads fort calibrating flow FACS settings |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- D’Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
- Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
- Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
- Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
- Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , (2012).
- Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy – from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2 (2013).
- Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
- Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).
