タンパク質レベルの組織や標準化された定量ウェスタンブロットによる開発全体の堅牢な比較

西部にしみが付くことは、検出し、タンパク質発現、組織ホモジネートまたは抽出物などを定量化に使われている手法です。年間で、この手法は、病^1,2の存在を確認する診断ツールとして使用することができます基礎と臨床の研究には多くの進歩につながっています。1979 年に硝酸セルロース シートにポリアクリルアミドのゲルからタンパク質を転送し、その後放射能標識または蛍光標識された二次抗体を用いたタンパク質を視覚化する方法としてまず述べた西部にしみが付くことまたはペルオキシダーゼ³。市販のキットや装置の開発、西部のしみが付く方法がますます標準化し、長年にわたって簡素化します。確かに、手法が今容易にさまざまな背景や経験のレベルで科学者によって実行されます。ただし、多くの同様の実験的手法と西部のしみの分析の結果簡単に選択して設計と実験の実行にも影響されます。したがっては、標準化された西部のしみが付くメソッドへのアクセスはない慎重な実験計画の必要性を隠蔽し、デザインする、それが重要です。実験的考察などに限られた、サンプル準備および処理、選択とタンパク質検出用抗体の検証、特に小規模または大規模のゲル-膜転送効率は ( 140 kDa)蛋白質^4,5,6,7,8,9。元のサンプルの蛋白質の品質は、その後西部のしみの分析の結果を決定する上で重要な役割を果たしています。さまざまなサンプルとソース、細胞株、動物モデルから組織死後人間組織などからタンパク質を得ることができると再現性のある結果を取得する処理と処理の一貫性が必要です。たとえば、サンプルの蛋白質の抽出のための長期的なストレージが必要な場合、それは、蛋白質は-80 ° C で一般的に安定しているが、抽出されたタンパク質と-80 ° C でそのまま組織の蛋白質の安定性の違いされている実現するために重要です報告された¹⁰。さらに、蛋白質量の再現性のある推定値を得るためには、サンプルの一貫した均質化が重要です。異なる換散バッファーと均質化法 (例えば、手動均質化自動化された方法と比べた場合) を最適化することは、大規模な定量実験を開始する前に必要があります。

蛋白質の表現の堅牢な定量的な結果を取得する蛋白質の読み込みと定量化の変動を補正するための正規化戦略が欠かせない。タンパク質 β-アクチンなどのハウスキーピング、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素 (GAPDH)、β-チューブリン α-チューブリン伝統的に使用されている定量化のための蛋白質のレベルを正規化します。しかし、過去数年^11,12ますます特定のハウスキーピング タンパク質定量用の正規化を批判されています。たとえば、ハウスキーピング タンパクの発現は⁴の同じ動物と条件病気様々 な^{4,15 の下の組織にわたって発達段階別13,14, で変化するか ,16,17}。したがって、特定のハウスキーピング蛋白質の使用は、異なる縦長で、様々 な実験条件の下で、さまざまな組織からタンパク質発現の間のより複雑な比較を行うの可能性を制限します。ハウスキーピング蛋白質蛋白質の変化の読み込みのコントロールにする代わりに総蛋白汚れ (TPS) の使用は、そのラベルとサンプルで現在のすべての蛋白質を可視化します。1 つの特定の蛋白質のレベルしたがって TPS 信号の定量化され匹敵する、再現可能な実験条件、サンプル タイプまたは発達 timepoint に関係なくするのではなく、TP により総蛋白負荷に基づいて信号の正規化.総蛋白質の汚れには、Ponceau S、ゲルの染色無料、Coomassie R-350、可視ルビー、Epicocconone、Amydo ブラック、Cy5 (文献参考文献 18) があります。これらの各メソッドは、特定の利点と制限、方法の選択は実験のセットアップ^4,18と同様、時間と利用可能なツールによって異なります。

膜内で読み込みと数量の変動を補正するため、TPS を使用、に加えて大規模なタンパク質発現解析を実行するときに特に別の膜間のサンプルを比較する必要がある場合があります。ただし、抗体の結合を効率と総蛋白質染色強度などの要因で変動は可能性があります別のゲルの分析は蛋白質のサンプルと膜間のばらつきに導入。このような状況で堅牢な定量化のために膜間の可変性を考慮してさらに正規化ステップを導入する必要です。これは、各実験の間で一定に保たれる個別に分析された膜の内部負荷標準を含めることによって達成することができます。この規格は、あらゆる蛋白質の溶解実験に含まれているすべての膜を渡る使用される十分な量で取得可能の形をとることができます。ここで、脳はすぐに均質化し、ライセート得られたタンパク質は、高濃度の蛋白質の重要な量を含んでいる (生後 5 日のマウスから得られた)、マウス脳のライセート使用します。3 通の内部標準を読み込み正規化し、直接比較する別の膜のサンプルをことができます。

ここでは、さまざまな組織、マウス モデル (疾患モデルを含む)、および発達縦長¹⁹間でタンパク質発現の多様性の複雑な比較を行うことを許可するように開発した詳細なプロトコルについて述べる。内部の読み込み標準の使用と蛍光 TPS を組み合わせて、サンプルおよび単一の実験内で比較することができます実験条件の数の既存の制限を克服することができました。このアプローチよりさまざまな組織、サンプル間で発現を探索する研究者、伝統的な西部のしみの技術の使用を拡大します。