Надежные сравнение уровня белка через ткани и на протяжении развития с использованием стандартизированных количественных западный Blotting

Западный blotting — это метод, который обычно используется для выявления и количественной оценки выражения протеина, в том числе в гомогенатах ткани или экстрактов. С годами эта техника привела к многие достижения в области фундаментальных и клинических исследований, где она может использоваться как средство диагностики для выявления наличия болезни^1,2. Западный blotting был впервые описан в 1979 году как метод для передачи белки от полиакриламидных гелей нитроцеллюлоза листы и впоследствии визуализировать белки, используя вторичные антитела, которые были либо радиоактивно конъюгированных флуоресцеин, помечены или пероксидаза³. Путем разработки коммерчески доступные комплекты и оборудование Западный blotting методы все более стандартизированной и упрощенный с годами. Действительно техника теперь легко осуществляется учеными с различной стола и уровни опыта. Однако как с много аналогичные экспериментальные методы, результаты анализов иммуноблоттинга легко влиянием выбор, сделанный в разработке и осуществлении эксперимента. Важно, таким образом, что доступность стандартизированных западной blotting методы не заслонять необходимость тщательного планирования экспериментальных и дизайн. Экспериментальная соображения включают, но не ограничиваясь, образец подготовки и обработки, отбора и проверки антител для обнаружения протеина и эффективность передачи гель мембраны особенно малых или больших ( 140 кДа) белки^4,5,6,,78,9. Качество белка исходного образца играет значительную роль в определении результатов последующих Западный анализ помаркой. Как белка могут быть извлечены из различных образцов и источников, включая линии клеток, тканей животных моделей и ткани трупа человека, последовательность обработки и обработки требуется для получения воспроизводимых результатов. Например когда требуется длительное хранение образцов для извлечения белков, важно понимать, что, хотя белок обычно стабилен при температуре-80 ° C, были различия в стабильности белка извлеченные протеины и нетронутыми тканей при температуре-80 ° C о¹⁰. Кроме того чтобы получить воспроизводимые оценки количества белка, последовательной гомогенизации образцов имеет решающее значение. Оптимизации различных лизис буферов и гомогенизации методы (например, по сравнению с автоматизированных методов ручной гомогенизации) могут потребоваться перед началом крупномасштабного количественный эксперимент.

Нормализация стратегий исправить для загрузки и количественной оценки изменчивости белка необходимо получить надежные, количественные результаты экспрессии белков. Уборка номера белков, таких как β-актина, α-тубулина, β-тубулина и Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) традиционно использовались для нормализации уровня белка для количественной оценки. Однако нормализации конкретные хозяйственные белки для целей количественной оценки чаще критикуют за последние несколько лет^11,12. Например можно изменить выражение уборки белков через различные этапы развития^13,14, через ткани из той же животных⁴и под различные болезни условия^{4,15 ,16,17}. Таким образом использование конкретных уборки белков ограничивает возможности более сложных сравнений между выражение протеина из различных тканей, в разных timepoints и в различных экспериментальных условиях. Альтернатива для уборки белки для управления для белка загрузки вариации является использование общего белка пятно (TPS) что этикетки и визуализирует всех белков, присутствующих в образце. TPS позволяет сигнал нормализации на основе общего белка нагрузки вместо того, чтобы уровень одного определенного белка и, следовательно, количественная оценка TPS сигнала должна быть сопоставимой и воспроизводимые независимо от экспериментальных условий, образец типа или развития timepoint . Примерами общего белка пятна Пуансо, пятно свободный гели, R-350 Кумасси, рубиново-Sypro, Epicocconone, Amydo черный и Cy5 (обзор в ссылка 18). Каждый из этих методов имеет свои преимущества и ограничения и выбор метода зависит от времени и средств, а также экспериментальная установка^4,18.

Наряду с использованием TPS исправить для загрузки в мембране и количественной оценки изменчивости, необходимо сравнить образцы между различными мембраны, особенно при выполнении анализ выражения протеина крупномасштабных. Однако изменчивость в таких факторов, как привязка эффективности и общей белок интенсивность пятно антитела могут вводить далее изменчивость между образцы протеина, которые анализируются на отдельных гели и мембран. Для надежной количественной оценки в этой ситуации поэтому необходимо ввести еще один шаг нормализации для учета изменчивости между мембраной. Это может быть достигнуто, включая стандарт внутренней нагрузки на каждом отдельно проанализированы мембран, которые является неизменным через эксперименты. Этот стандарт может принимать форму любой белок lysate, который может быть получен в достаточных количествах для использования во всех мембраны, включены в эксперимент. Здесь мы используем lysate мыши мозга (полученные от 5 день старых мышей управления), как легко гомогенизированных мозга и полученный белка lysate содержит значительное количество белка в высокой концентрации. Загрузка внутренний стандарт в трех экземплярах позволяет образцы на отдельных мембраны для нормализации и сравнивается непосредственно.

Здесь мы описываем подробный протокол, который мы разработали, чтобы позволить нам для проведения сложных сравнений белка выражение вариации различных тканей, мыши модели (включая модели заболеванием) и развития timepoints¹⁹. Объединив флуоресцентный TPS с использованием внутренней нагрузки стандарта, мы смогли преодолеть существующие ограничения в количество образцов и экспериментальных условий, которые можно сравнивать в рамках одного эксперимента. Такой подход расширяет использование методов традиционной западной помарки, тем самым позволяя исследователей, чтобы лучше изучить белков через различных тканей и образцы.