Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting
Summary
Diese Methode beschreibt, einen stabile und reproduzierbaren Ansatz für den Vergleich der Proteingehalte in verschiedenen Geweben und an verschiedenen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten mit einem standardisierten quantitativen westlichen befleckenden Ansatz.
Abstract
Westliche Beflecken ist eine Technik, die häufig verwendet wird, zu erkennen und zu quantifizieren, Protein-Expression. Im Laufe der Jahre führte diese Technik zu viele Fortschritte in der Grundlagenforschung und klinische Forschung. Allerdings ist wie bei vielen ähnlichen experimentellen Techniken, die Ergebnis der Western-Blot Analysen leicht Entscheidungen bei der Gestaltung und Durchführung des Experiments beeinflusst. Spezifische Zimmermädchen Proteine traditionell verwendet wurden, um Protein-Ebene für die Quantifizierung zu normalisieren, aber diese haben eine Reihe von Einschränkungen und sind daher in den letzten Jahren zunehmend kritisiert worden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das wir entwickelt haben, um komplexe Vergleiche von Protein Ausdruck Variation in verschiedenen Geweben, Maus-Modellen (einschließlich Krankheitsmodelle) und Entwicklungsstörungen Zeitpunkte auf höchstem Niveau zu ermöglichen. Durch die Verwendung eines fluoreszierenden Gesamtprotein Fleckes und Einführung in die Verwendung von einem internen standard laden, es ist möglich, bestehende Einschränkungen in der Anzahl der Stichproben zu überwinden, die in Experimenten verglichen werden können und systematisch vergleichen Proteingehalte in eine Reihe von experimentellen Bedingungen. Dieser Ansatz erweitert die Verwendung von traditionellen western-Blot-Techniken, so dass Forscher besser Proteinexpression in verschiedenen Geweben und Proben zu untersuchen.
Introduction
Westliche Beflecken ist eine Technik, die häufig verwendet wird, zu erkennen und zu quantifizieren, Protein-Expression, einschließlich Gewebe Homogenates oder Extrakte. Im Laufe der Jahre hat diese Technik führte zu viele Fortschritte in der Grundlagenforschung und klinische Forschung, wo es als diagnostisches Werkzeug lässt sich das Vorhandensein der Krankheit1,2identifizieren. Westliche Beflecken wurde erstmals im Jahr 1979 als eine Methode, um Proteine von Polyacrylamid-Gele auf Nitrozellulose Blätter übertragen und anschließend visualisieren Proteine mit sekundären Antikörpern, die waren entweder radioaktiv gekennzeichnet oder konjugiert zu Fluorescein beschrieben oder Peroxidase-3. Durch die Entwicklung von kommerziell erhältlichen Kits und Ausrüstung wurden westliche befleckende Methoden zunehmend standardisiert und vereinfacht im Laufe der Jahre. Die Technik ist in der Tat, jetzt leicht von Wissenschaftlern mit unterschiedlichen Hintergründen und Ebenen der Erfahrung durchgeführt. Allerdings ist wie bei vielen ähnlichen experimentellen Techniken, die Ergebnis der Western-Blot Analysen leicht Entscheidungen bei der Gestaltung und Durchführung des Experiments beeinflusst. Es ist wichtig, daher, dass die Zugänglichkeit von standardisierten westliche befleckende Methoden nicht die Notwendigkeit sorgfältiger experimentelle Planung verdecken und design. Experimentelle Überlegungen gehören, jedoch nicht beschränkt auf, Probe Vorbereitung und Handhabung, Auswahl und Validierung von Antikörpern für die Proteindetektion und Gel-Membran Auftragswirkungsgrad von besonders klein oder groß ( 140 kDa) Proteine4,5,6,7,8,9. Protein-Qualität der ursprünglichen Probe spielt eine bedeutende Rolle bei der Bestimmung, des Ergebnis der anschließenden Western-Blot Analyse. Wie Protein aus einer Vielzahl von Proben und Quellen, einschließlich die Zelllinien, Gewebe aus Tiermodellen und Post-Mortem-menschlichen Geweben, extrahiert werden kann ist Konsistenz in Handhabung und Verarbeitung erforderlich, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Zum Beispiel, wenn langfristige Lagerung von Proben zur Proteingewinnung erforderlich ist, ist es wichtig zu erkennen, dass obwohl Protein in der Regel stabil bei-80 ° C ist, Unterschiede in Proteinstabilität extrahierten Proteine und intakten Gewebe bei-80 ° C gewesen sein gemeldeten10. Darüber hinaus ist konsequente Homogenisierung der Proben um reproduzierbare Schätzungen der Proteinmengen zu erhalten, entscheidend. Optimierung der verschiedenen Lyse Puffer und Homogenisierung Methoden (z. B. manuelle Homogenisierung im Vergleich zu automatisierten Methoden) kann erforderlich sein, vor Beginn der quantitativen Großversuch.
Normalisierung Strategien für Protein be- und Quantifizierung Variabilität zu korrigieren sind wichtig, robuste, quantitative Ergebnisse der Proteinexpression erhalten. Housekeeping Proteine wie β-Aktin, haben α-Tubulin, β-Tubulin und Glyceraldehyde-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) traditionell verwendet, um Protein-Ebene für die Quantifizierung zu normalisieren. Normierung auf spezifische Zimmermädchen Proteine Quantifizierung Zwecken wurde jedoch zunehmend über die letzten paar Jahre11,12kritisiert. Beispielsweise kann der Ausdruck Hauswirtschaft Proteine in unterschiedlichen Entwicklungsstadien13,14, über Gewebe aus dem gleichen Tier4und unter verschiedenen Krankheiten Bedingungen4,15 ändern. ,16,17. Daher schränkt die Verwendung von bestimmten Haushalt Proteine die Möglichkeiten der komplexere Vergleiche zwischen Proteinexpression aus verschiedenen Geweben, an verschiedenen Zeitpunkten und unter verschiedenen experimentelle Bedingungen. Eine Alternative zum Haushalt Proteine Steuern für Protein laden Variante ist die Verwendung des Fleckes Gesamt-Protein (TPS), Etiketten und visualisiert alle Proteine in einer Probe vorhanden. TPS ermöglicht Signal Normalisierung anhand der Gesamt-Protein Last anstatt ein spezifisches Protein und somit Quantifizierung der TPS Signal sollte vergleichbar und reproduzierbar unabhängig von Versuchsbedingung, Probentyp oder Entwicklungsstörungen timepoint . Beispiele für Gesamtprotein Flecken Ponceau S, fleckenfreie Gele Coomassie R-350, Sypro-Rubin, Epicocconone, Amydo Black und Cy5 (überarbeitet in Nr. 18). Jede dieser Methoden hat spezifische Vorteile und Beschränkungen und Auswahl richtet sich nach der Zeit und Werkzeuge zur Verfügung, sowie der Versuchsaufbau4,18.
Zusätzlich zur Verwendung einer TPS, um innerhalb der Membran be- und Quantifizierung Variabilität zu korrigieren, kann es notwendig, Proben zwischen verschiedenen Membranen, besonders bei großflächigen Proteinanalytik Ausdruck zu vergleichen sein. Variabilität in Faktoren wie Antikörper binden Effizienz und Total Protein Fleck Intensität kann jedoch weitere Variabilität zwischen Proteinproben, die analysiert werden auf separaten Gele und Membranen einführen. Für robuste Quantifizierung in dieser Situation ist es daher notwendig, einen weiteren Normalisierung Schritt um Variabilität zwischen Membran zu berücksichtigen. Dies kann erreicht werden durch die Einbeziehung eines internen laden Standards auf jedem der separat analysierten Membranen, die über Experimente konstant gehalten wird. Dieser Standard kann haben die Form von jedem Protein lysate, in ausreichenden Mengen verwendet werden, über alle Membranen enthalten im Experiment gewonnen werden können. Hier verwenden wir ein lysate Gehirn der Maus (5 Tage alten Kontroll-Mäusen entnommen), Gehirn wird leicht homogenisiert und das gewonnene lysate Protein enthält eine erhebliche Menge an Protein in einer hohen Konzentration. Laden eines internen Standards in dreifacher Ausfertigung kann Proben auf separaten Membranen normalisiert und direkt verglichen werden.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das wir entwickelt haben, um komplexe Vergleiche von Protein Ausdruck Variation in verschiedenen Geweben, Maus-Modellen (einschließlich Krankheitsmodelle) und Entwicklungsstörungen Zeitpunkte19auf höchstem Niveau zu ermöglichen. Durch die Kombination einer fluoreszierenden TPS mit dem Einsatz von einem internen standard laden, konnten wir zur Überwindung bestehender Einschränkungen in der Anzahl der Proben und experimentellen Bedingungen, die in einem einzigen Experiment verglichen werden kann. Dieser Ansatz erweitert die Verwendung von traditionellen Western-Blot-Techniken, so dass Forscher besser Proteinexpression in verschiedenen Geweben und Proben zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit der geeigneten Versuchsdesign, Kontrollmaßnahmen und statistische Analyse westliche Beflecken lässt sich verlässliche quantitative Schätzungen der Proteinexpression innerhalb und zwischen ein vielfältiges Angebot an biologischen Proben vornehmen. Das Protokoll, die, das wir im aktuellen Manuskript beschreiben, soll dienen als Richtlinien für Forscher auf der Suche nach Western blotting um Quantitative Analyse auf größeren und komplexeren Gruppen von Proben, verpflichten sich, durch eine Kombination von Fluore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.J.N.G. wird vom Wellcome Trust (Grant 106098/Z/14/Z) unterstützt. Sonstige Finanzierung wurde durch den Trust SMA (SMA UK Konsortium; vorgesehen T.H.G. & Y-T. (H.) SMA (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), der University of Edinburgh DTP in Präzision Medizin (T.H.G., l.l. & U.V.M.) und Europa Euan MacDonald Zentrum zur Erforschung von Motoneuronen Krankheiten (T.H.G).
Materials
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | — | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
References
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