مقارنة مستويات البروتين عبر الأنسجة، وفي جميع أنحاء تطوير استخدام النشاف الغربية كمية موحدة قوية

النشاف الغربية هو أسلوب الذي يستخدم عادة لكشف وتحديد التعبير البروتين، بما في ذلك في هوموجيناتيس الأنسجة أو مقتطفات. على مر السنين، أدى هذا الأسلوب إلى العديد من التطورات في مجال البحوث الأساسية والسريرية على حد سواء، حيث يمكن استخدامه كأداة تشخيصية لتحديد وجود المرض^1،2. النشاف الغربية وصفت أول مرة في عام 1979 كوسيلة لنقل البروتينات من المواد الهلامية polyacrylamide لأوراق النيتروسليلوز وبعد ذلك وضع تصور البروتينات باستخدام الأجسام المضادة الثانوية التي تم بالاشعاع المسمى أو مترافق ب fluorescein أو البيروكسيديز³. من خلال تطوير أدوات متوفرة تجارياً ومعدات، تم الطرق الغربية النشاف متزايدة موحدة ومبسطة على مر السنين. والواقع أن التقنية الآن سهولة يؤديها العلماء مع تباين الخلفيات والمستويات من الخبرة. ومع ذلك، كما هو الحال مع العديد من تقنيات تجريبية مماثلة، نتائج التحليلات الغربية وصمة عار بسهولة يتأثر بالاختيارات في تصميم وتنفيذ التجربة. ولذلك، من المهم أن إمكانية الحصول على أساليب موحدة النشاف الغربية لا تحجب الحاجة إلى تخطيط دقيق التجريبي وتصميم. اعتبارات تجريبية تشمل، ولكن ليست إعداد محدودة إلى، عينة والمناولة والتحديد والتحقق من الأجسام المضادة للكشف عن البروتين وكفاءة نقل جل لغشاء خاصة صغيرة أو كبيرة ( كاتشين 140) بروتينات^4،5،،من^67،،من⁸⁹. جودة البروتين من العينة الأصلية تلعب دوراً هاما في تحديد نتائج تحليل لطخة غربية اللاحقة. كما يمكن استخراج البروتين من مجموعة متنوعة واسعة من عينات والمصادر، بما في ذلك خطوط الخلايا والأنسجة من النماذج الحيوانية والأنسجة البشرية بعد الوفاة، مطلوب الاتساق في المناولة والتجهيز للحصول على النتائج استنساخه. على سبيل المثال، عند التخزين على المدى الطويل من عينات لاستخراج البروتين المطلوب، من المهم أن ندرك أنه على الرغم من أن البروتين مستقرة بصفة عامة في-80 درجة مئوية، كانت الاختلافات في الاستقرار البروتين بين البروتينات المستخرجة وأنسجة سليمة في-80 درجة مئوية ¹⁰من المبلغ عنها. وعلاوة على ذلك، للحصول على تقديرات استنساخه من كميات البروتين، يتفق تجانس العينات أمر حاسم. قد يكون مطلوباً الاستفادة المثلى من تحلل مختلف المخازن المؤقتة وتجانس أساليب (مثل دليل التجانس مقارنة بأساليب مؤتمتة) قبل البدء في تجربة كمية على نطاق واسع.

استراتيجيات التطبيع لتصحيح لتقلب تحميل وتقدير كمية البروتين ضرورية للحصول على نتائج قوية وكمية البروتين التعبير. التدبير المنزلي البروتينات مثل β-أكتين، α-tubulin، β-tubulin ونازعه جليسيرالديهيدي-3-الفوسفات (جابده) تقليديا قد استخدمت لتطبيع مستويات البروتين للقياس الكمي. ومع ذلك، تطبيع للبروتينات التدبير المنزلي محددة لأغراض القياس الكمي قد انتقدت متزايدة على مدى السنوات القليلة الماضية^11،12. على سبيل المثال، يمكنك تغيير التعبير عن التدبير المنزلي البروتينات عبر مراحل تنموية مختلفة^13،14، عبر أنسجة من نفس الحيوان⁴، وفي إطار مختلف الأمراض الشروط^{4،15 ،،}من¹⁶¹⁷. ولذلك، استخدام البروتينات التدبير المنزلي محددة يحد من الإمكانيات لإجراء مقارنات أكثر تعقيداً بين التعبير البروتين من أنسجة مختلفة، في تيميبوينتس مختلفة وفي ظل مختلف الظروف التجريبية. كبديل للبروتينات التدبير المنزلي لعنصر التحكم للبروتين تحميل الاختلاف هو استخدام وصمة مجموع البروتين (TPS) تلك التسميات ويتصور جميع البروتينات الموجودة في عينة. يسمح TPS تطبيع إشارة استناداً إلى تحميل مجموع البروتين بدلاً من مستويات البروتين محددة واحدة والتحديد الكمي لإشارة النقاط التجارية ولذلك ينبغي أن تكون قابلة للمقارنة واستنساخه بغض النظر عن حالة تجريبية، ونوع العينة أو تيميبوينت الإنمائية . أمثلة من البقع مجموع البروتين S بونسو، الهلام خالية من وصمة عار وأخذ R-350، سيبرو-روبي، ابيكوككونوني، الأسود أميدو و Cy5 (إعادة النظر في الرقم 18). كل من هذه الأساليب مزايا محددة وقيود واختيار أسلوب يعتمد على الوقت والأدوات المتاحة، فضلا عن الإعداد التجريبية^4،18.

بالإضافة إلى استخدام النقاط التجارية تصحيح لتحميل داخل الغشاء والتغير الكمي، فإنه قد يكون من الضروري على مقارنة العينات بين الأغشية المختلفة، لا سيما عند إجراء تحليل التعبير البروتين على نطاق واسع. ومع ذلك، قد إدخال التغير في عوامل مثل جسم ملزمة الكفاءة ومجموع البروتين وصمة عار كثافة المزيد من تقلب بين بروتين العينات التي يتم تحليلها في المواد الهلامية منفصلة والأغشية. التقدير الكمي قوية في هذه الحالة، من الضروري لذلك إدخال خطوة تطبيع أخرى تستأثر بتباين بين الغشاء. هذا يمكن أن يتحقق بها بما في ذلك معيار تحميل داخلية في كل من الأغشية التي تم تحليلها بشكل منفصل أن تظل ثابتة عبر التجارب. هذا المعيار يمكن أن تتخذ شكل أي بروتين ليساتي التي يمكن الحصول عليها بكميات كافية لاستخدامها عبر جميع الأغشية المدرجة في هذه التجربة. هنا، نحن نستخدم الدماغ الماوس (التي تم الحصول عليها من 5 يوم من العمر مكافحة الفئران)، كما هو سهولة تجانس المخ والبروتين التي تم الحصول عليها ليستي يحتوي على كمية كبيرة من البروتين بتركيز عال. تحميل معياراً داخلية في ثلاث نسخ يسمح عينات في الأغشية منفصلة إلى تطبيع ومقارنة مباشرة.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة التي قمنا بتطوير للسماح لنا بإجراء مقارنات معقدة من البروتين التعبير التباين عبر الأنسجة المختلفة، ونماذج الماوس (بما في ذلك نماذج المرض)، وتيميبوينتس الإنمائية¹⁹. عن طريق الجمع بين TPS فلورسنت باستخدام التحميل الداخلية القياسية، كنا قادرين على التغلب على القيود القائمة في عدد العينات والظروف التجريبية التي يمكن مقارنتها في تجربة واحدة. يوسع هذا النهج استخدام التقنيات التقليدية لطخة غربية، مما يسمح للباحثين استكشاف أفضل تعبير البروتين عبر مختلف الأنسجة والعينات.