Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting

Western Blot es una técnica que se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar la expresión de la proteína, incluyendo en homogenados de tejido o extractos. Con los años, esta técnica ha conducido a muchos avances en la investigación básica y clínica, donde puede ser utilizado como una herramienta de diagnóstico para identificar la presencia de enfermedad^1,2. Primero borrar occidental fue descrito en 1979 como un método para transferir proteínas de geles de poliacrilamida a hojas de nitrocelulosa y posteriormente visualizar las proteínas usando los anticuerpos secundarios que fueron radiactivo etiquetados o conjugados con fluoresceína o peroxidasa³. Mediante el desarrollo de kits disponibles en el mercado y el equipo, Western Blot métodos han sido cada vez más estandarizados y simplificadas sobre los años. De hecho, la técnica ahora es fácilmente realizada por científicos con diferentes orígenes y niveles de experiencia. Sin embargo, como con muchas técnicas experimentales similares, los resultados de los análisis de Western blot es fácilmente influenciado por decisiones en el diseño y ejecución del experimento. Es importante, por lo tanto, que la accesibilidad de métodos estandarizados de Blot Western no obscurecer la necesidad de una cuidadosa planificación experimental y diseño. Consideraciones experimentales incluyen, pero no limitada a, muestra la preparación y manipulación, selección y validación de anticuerpos para la detección de la proteína y la eficiencia de transferencia de gel a la membrana de particularmente grande o pequeño ( 140 kDa) proteínas^4,5,6,7,8,9. Calidad de la proteína de la muestra original juega un papel importante en la determinación de los resultados de los análisis de Western blot posterior. Como proteína puede ser extraída de una gran variedad de muestras y de fuentes, incluyendo líneas celulares, tejidos de modelos animales y tejidos humanos post mortem, consistencia en el manejo y procesamiento es necesaria para obtener resultados reproducibles. Por ejemplo, cuando se requiere almacenamiento a largo plazo de muestras para la extracción de proteínas, es importante tener en cuenta que, aunque la proteína es generalmente estable a-80 º C, diferencias en la estabilidad de la proteína extraída de las proteínas y los tejidos intactos a-80 ° C han sido reportado¹⁰. Además, para obtener estimaciones reproducibles de cantidades de proteína, consecuente homogeneización de las muestras es crucial. Optimización de métodos de homogeneización (p. ej., homogeneización manual en comparación con métodos automatizados) y almacenadores intermediarios de la lisis diferentes puede ser necesario antes de comenzar un experimento a gran escala cuantitativo.

Estrategias de normalización para corregir la variabilidad de carga y la cuantificación de proteína son esenciales para obtener resultados robustos, cuantitativos de la expresión de la proteína. Servicio de limpieza tales como β-actina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), α-tubulina y β-tubulina han tradicionalmente utilizados para normalizar los niveles de proteína para la cuantificación. Sin embargo, normalización a las proteínas de limpieza específico para propósitos de cuantificación ha sido criticado cada vez más en el pasado pocos años^11,12. Por ejemplo, puede cambiar la expresión de proteínas de limpieza a través de diferentes etapas de desarrollo^13,14, a través de los tejidos del animal mismo⁴y bajo diversas enfermedades condiciones^{4,15 ,16,17}. Por lo tanto, el uso de proteínas específicas de limpieza limita las posibilidades de realizar comparaciones más complejas entre la expresión de proteínas de diversos tejidos, en diferentes puntos de tiempo y bajo diferentes condiciones experimentales. Una alternativa a las proteínas de la limpieza a control para variación de la carga de la proteína es el uso de un colorante de proteínas totales (TPS) que las etiquetas y visualiza todas las proteínas presentes en una muestra. TPS permite la normalización de la señal en base a proteína total carga en lugar de niveles de una proteína específica y por lo tanto la cuantificación de la señal TPS deben ser comparables y reproducibles independientemente de la condición experimental, tipo de muestra o punto de tiempo del desarrollo . Ejemplos de manchas de proteína total incluyen Ponceau S, geles mancha-libre, Coomassie R-350, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo Black y Cy5 (revisado en Ref. 18). Cada uno de estos métodos tiene limitaciones y ventajas específicas y selección del método depende del tiempo y las herramientas disponibles así como la disposición experimental^4,18.

Además de utilizar un TPS para corregir para la carga dentro de la membrana y variabilidad de cuantificación, puede ser necesario comparar muestras entre diferentes membranas, particularmente cuando se realiza el análisis de expresión de proteínas a gran escala. Sin embargo, variabilidad en los factores tales como eficiencia y total intensidad de tinción de proteínas de unión del anticuerpo puede introducir mayor variabilidad entre las muestras de proteína que se analizan en diferentes geles y membranas. Para la cuantificación sólida en esta situación, por lo tanto es necesario introducir un nuevo paso de normalización para tener en cuenta la variabilidad entre la membrana. Esto puede lograrse mediante la inclusión de una norma interna de la carga en cada una de las membranas analizadas por separado que se mantiene constante a través de experimentos. Esta norma puede tomar la forma de cualquier proteína lisada que puede obtenerse en cantidad suficiente para usarse en todas las membranas en el experimento. Aquí, utilizamos un lisado de cerebro de ratón (Obtenido de los ratones de control 5 días de edad), como cerebro fácilmente está homogeneizado y la proteína obtenida lisada contiene una cantidad significativa de proteína en alta concentración. Carga estándar interno por triplicado permite muestras en separar las membranas a ser normalizado y comparadas directamente.

Aquí, describimos un protocolo detallado que hemos desarrollado para que podamos llevar a cabo complejas comparaciones de la variación de expresión de la proteína a través de diferentes tejidos, modelos de ratón (incluyendo modelos de la enfermedad) y los puntos de tiempo del desarrollo¹⁹. Combinando un TPS fluorescente con el uso de un estándar interno de la carga, hemos sido capaces de superar las limitaciones existentes en el número de muestras y condiciones experimentales que pueden compararse en un solo experimento. Este enfoque amplía el uso de técnicas tradicionales de Western blot, lo que permite a los investigadores explorar mejor expresión de la proteína a través de muestras y diferentes tejidos.