Summary

Synthese en Bioconjugation van Thiol-reactieve reagentia voor de oprichting van Site-selectief bewerkt Immunoconjugates

Published: March 06, 2019
doi:

Summary

In dit protocol beschrijven we de synthese van PODS, een phenyoxadiazolyl methyl-sulfon gebaseerde reagens voor de site-selectieve bevestiging van cargos aan de thiolen van biomoleculen, met name antilichamen. Daarnaast beschrijven we de synthese en de karakterisering van een Peul-bevattende bifunctionele complexvormer en zijn geconjugeerde aan een model antilichaam.

Abstract

Maleimide-bevattende bifunctionele sondes zijn tewerkgesteld voor decennia voor de site-selectieve wijziging van thiolen in biomoleculen, vooral antilichamen. Maleimide gebaseerde geconjugeerde weergeven nog beperkte stabiliteit in vivo omdat de koppeling van de thioether succinimidyl een retro-Michael reactie kan ondergaan. Dit, natuurlijk, kan leiden tot het vrijgeven van de radioactieve lading of de uitwisseling met thiol-bevattende biomoleculen in omloop. Beide processen kunnen produceren verhoogde activiteit concentraties in gezonde organen evenals activiteit concentraties in target weefsel, wat resulteert in verminderde imaging contrast en lagere therapeutische ratio daalde. In 2018, meldden we de oprichting van een modulair, stabiel en gemakkelijk toegankelijk phenyloxadiazolyl methyl-sulfon reagens — genaamd ‘Peulen’ — als een platform voor thiol gebaseerde bioconjugations. We hebben duidelijk aangetoond dat site-selectieve bioconjugations peulen gebaseerde reproducibly en krachtig homogene, duidelijk omschreven, zeer immunoreactive en zeer stabiele radioimmunoconjugaten maken. Bovendien hebben preklinische experimenten in lymfkliertest modellen van colorectal kanker aangetoond dat deze site-selectief met het label radioimmunoconjugaten tentoonstelling veruit superieur in vivo prestaties in vergelijking met radiolabeled antilichamen gesynthetiseerd via maleimide gebaseerde vervoegingen. In dit protocol beschrijven we de synthese van de vier stappen van PODS, de oprichting van een bifunctionele peulen dragende variant van de alomtegenwoordige complexvormer DOTA (PODS-DOTA), en de vervoeging van PODS-DOTA aan de HER2-targeting antilichaam trastuzumab.

Introduction

Radiofarmaceutische chemici hebben lang benut de selectiviteit en de specificiteit van antilichamen voor biomarkers voor ziekte voor zowel nucleaire beeldvorming en radiotherapie1gericht. Verreweg de meest voorkomende benadering van de radiolabeling van antilichamen is gebaseerd op de blinde bevestiging van radiolabeled prosthetic groepen of radiometal chelaatvormers aan aminozuren — meestal lysines — binnen de structuur van de immunoglobuline ( Figuur 1A)2. Terwijl deze strategie zeker effectief is, kan het willekeurige, niet-site-specifieke karakter leiden tot problemen. Specifiek, traditionele bioconjugation benaderingen produceren slecht gedefinieerde en heterogene immunoconjugates samengesteld uit mengsels van duizenden verschillende regioisomers, elk met een eigen set van biologische en farmacologische eigenschappen3. Bovendien kan willekeurige bioconjugation de immunoreactivity van antilichamen belemmeren, als de lading wordt toegevoegd aan de immunoglobuline van antigeen-bindende domeinen.

Door de jaren heen, een verscheidenheid van site-specific en site-selectieve bioconjugation strategieën werden ontwikkeld om deze problemen4,5. De meest voorkomende van deze benaderingen is afhankelijk van de afbinding van maleimide-bevattende sondes aan de sulfaatzuurstof groepen van cysteines (figuur 1B). IgG1 antilichamen van nature bevatten 4 Inter keten disulfide bruggen, verbanden die kunnen worden selectief verminderd rendement gratis thiolen staat voor het ondergaan van Michael toevoeging reacties met maleimides te succinimidyl thioether obligaties vormen. Het gebruik van thiolen en maleimides is zeker een verbetering ten opzichte van traditionele methoden, en een breed scala aan maleimide-bevattende synthons en bifunctionele chelaatvormers momenteel beschikbaar zijn. Het is echter belangrijk op te merken dat deze methode ernstige beperkingen zo goed heeft. Maleimide gebaseerde immunoconjugates vertonen beperkte stabiliteit in vivo omdat de koppeling van de thioether kan het ondergaan van een retro-Michael reactie (Figuur 2)6,7,8,9, 10. dit, natuurlijk, kan leiden tot het vrijgeven van de radioactieve lading of de uitwisseling met thiol-bevattende biomoleculen in omloop (bijvoorbeeld glutathion of serum albumine). Beide processen kunnen verhogen activiteit concentraties in gezonde organen evenals activiteit concentraties in target weefsel, wat resulteert in verminderde imaging contrast en lagere therapeutische verhoudingsgetallen verlagen. Verschillende alternatieve thiol-reactieve reagentia zijn ontwikkeld in een poging om het omzeilen van deze kwesties, met inbegrip van tosylates, bromo – en jood-acetyls, en vinyl sulfones11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. echter, al deze benaderingen hebben beperkingen die hun wijdverbreide toepassing hebben gehinderd.

Ongeveer vijf jaar geleden, pionier het laboratorium van de late Carlos Barbas III at The Scripps Research Institute het gebruik van phenyloxadiazolyl methyl sulfones als reagentia voor de selectieve vorming van zeer stabiele verbanden met thiolen (Figuur 1 c en figuur 3) 18 , 19. de auteurs werkzaam een phenyloxadiazolyl methyl-sulfon dragende variant van fluoresceïne wijzigen van verschillende antilichamen ontworpen om vrije cysteïne residuen, uiteindelijk het produceren van immunoconjugates met hogere stabiliteit dan analoog constructies gemaakt met behulp van de maleimide gebaseerde sondes. Bij het zien van dit veelbelovende werk, waren we enigszins verrast dat deze technologie alleen nauwelijks in de radiochemie gebruikt was en nog al helemaal niet in de synthese van bifunctionele chelaatvormers of radioimmunoconjugaten20,21 gebruikt had . Dit gebrek aan toepassingen, maar al snel begon te meer zin te maken: verschillende pogingen tot aanschaf van de reagens van Sigma-Aldrich resulteerde in de ontvangst van complexe mengsels van afbraakproducten daarvan met < 15% van de gewenste stof. Bovendien, synthese van het gerapporteerde reagens onszelf was niet een realistische optie hetzij, als de gepubliceerde synthetische route enigszins omslachtig is en verfijnde organische chemie apparatuur vereist dat de meeste radio-chemie en moleculaire beeldvorming laboratoria — met inbegrip van onze — gewoon doen niet bezitten.

In reactie op deze belemmeringen zetten we uit te maken van een gemakkelijk toegankelijk en zeer stabiele phenyloxadiazolyl-methyl-sulfon reagens dat kan worden verkregen via een robuust en redelijk facile synthetische route. Eerder dit jaar, berichtten we de oprichting van een modulair, stabiel en gemakkelijk toegankelijk phenyloxadiazolyl methyl-sulfon reagens — genaamd ‘Peulen’ — als een platform voor thiol gebaseerde bioconjugations (Figuur 1 c en figuur 3)22. Het belangrijkste verschil tussen peulen en het reagens gerapporteerd door Barbas, et al. is dat de voormalige maakt gebruik van een aniline ring gehecht aan de phenyloxadiazolyl-methyl-sulfon groep, terwijl de laatste beschikt over een fenol in dezelfde positie (Figuur 4). Deze wijziging vereenvoudigt een meer eenvoudige en toegankelijke synthetische route, evenals — als onze ervaring met de verkrijgbare compound emblematisch is — een stabieler definitieve reagens. In dit werk, we ook een paar peulen dragende bifunctionele chelaatvormers gesynthetiseerd — PODS-DFO en peulen-CHX-A”-DTPA — ter vergemakkelijking van de oprichting van 89Zr- en 177Lu-label radioimmunoconjugaten, respectievelijk. Zoals we bespreken zullen, hebben we aangetoond dat site-selectieve bioconjugations peulen gebaseerde reproducibly en krachtig homogene, duidelijk omschreven, zeer immunoreactive en zeer stabiele radioimmunoconjugaten maken. Bovendien hebben preklinische experimenten in lymfkliertest modellen van colorectal kanker aangetoond dat deze site-selectief met het label radioimmunoconjugaten tentoonstelling superieur in vivo prestaties in vergelijking met radiolabeled antilichamen gesynthetiseerd via maleimide gebaseerde vervoegingen.

Het overkoepelende doel van dit werk is het maken van duidelijke, homogene, zeer stabiele en zeer immunoreactive immunoconjugates voor in vitro en in vivo toepassingen vereenvoudigen. De synthetische benadering is eenvoudig genoeg om te worden uitgevoerd in bijna elk laboratorium, en de bovenliggende PODS-reagens kan worden aangepast met een overvloed aan verschillende chelaatvormers, fluorophores of lading. In dit protocol en de begeleidende video beschrijven we de eenvoudige, vier-stappen synthese van peulen (Figuur 5); de oprichting van een variant van de peulen-invloed van DOTA, een veel gebruikte complexvormer voor de coördinatie van 64Cu, 68Ga 111In, 177Lu en 225Ac (Figuur 6); en de bioconjugation van PODS-DOTA aan een model antilichaam, de HER2-targeting IgG1-trastuzumab (Figuur 7).

Protocol

1. de synthese van 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1) Opmerking: Als gevolg van de licht-gevoeligheid van de compound, houden alle reacties in folie bedekte vaartuigen. In een 10 mL ronde onderkant kolf, los 100 mg (0.517 mmol, 1 equivalent) van 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol in 3 mL methanol. Voeg aan deze oplossing, 360 l diisopropylethylamine (DIPEA; 2.07 mmol; 4 equivalenten; watervrij) en een kleine magnetische roer bar. Bedek de kolf met e…

Representative Results

De eerste vier fasen van dit protocol — de synthese van PODS — zijn ontworpen om robuust en betrouwbaar. De deprotonering en vervanging van 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol om te vormen van de gewenste thioether-product biedt de thioether in > 99% rendement na slechts 45 minuten. Vervolgens werd de afbinding tussen 1 en N-Boc-N’-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine bereikt via een standaard peptide koppeling procedure, wat resulteert in de collectie …

Discussion

In dit verslag, hebben wij besloten niet op te nemen van de eventuele protocollen voor radiolabeling of in vivo experimenten. Onze redenen zijn eenvoudig. Met betrekking tot de voormalige, de radiolabeling van een immunoconjugate peulen gebaseerde verschilt niet helemaal van die van een immunoconjugate gesynthetiseerd met behulp van andere strategieën van bioconjugation, en deze procedures hebben uitvoerig herzien elders2 . Met betrekking tot de laatste, kunnen de specifieke kenmerken van preklin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Dr. Sai Kiran Sharma voor nuttig gesprekken.

Materials

5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol Sigma-Aldrich 675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube Eppendorf 925000090
1.5 mL Microcentrifugal Tube Fisherbrand 05-408-129
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore EN300000141G
Cyclohexane Fisher Scientific C556-4
Dichloromethane Fisher Scientific AC383780010
Diisopropylethylamine MP Biomedicals, LLC 150915
Dimethylsulfoxide Fisher Scientific 31-727-5100ML
Ethyl Acetate Fisher Scientific E145 4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Iodomethane Sigma-Aldrich 289566-100G
Magnesium Sulfate Acros Organics 413485000
m-chloroperbenzoic acid Sigma-Aldrich 273031
Methanol Fisher Scientific A412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine Sigma-Aldrich 671401 Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich 3450
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P5493 10× Concentration
p-SCN-Bn-DOTA Macrocyclics B-205 Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17085101
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich S7795
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
TCEP ThermoFischer Scientific 20490
Triethylamine Fisher Scientific AC157911000
Trifluoroacetic Acid Fisher Scientific A116-50

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
  3. Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
  4. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
  5. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
  6. Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
  7. Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
  8. Shen, B. -. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
  9. Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
  10. Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
  11. Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
  12. Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
  13. Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab’ fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
  14. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
  15. Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
  16. Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
  17. Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
  18. Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
  19. Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
  20. Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
  21. Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
  22. Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
  23. Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
  24. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
  25. Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
  26. Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
  27. Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
  28. Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
  29. Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
  30. Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
  31. Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
  32. Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
  33. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  34. Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
  35. Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
  36. O’Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
  37. Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
  38. Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).

Play Video

Cite This Article
Davydova, M., Dewaele Le Roi, G., Adumeau, P., Zeglis, B. M. Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates. J. Vis. Exp. (145), e59063, doi:10.3791/59063 (2019).

View Video