硫醇反应试剂的合成与生物共轭作用--用于原位选择性修饰免疫共轭的生成

长期以来, 放射性药物化学家一直在利用疾病生物标志物抗体的选择性和特异性用于核成像和靶向放射治疗¹。抗体的放射标记最常见的方法是基于放射性标记的假体群或放射性螯合剂不加区别地附着在免疫球蛋白结构中的氨基酸–通常是赖氨酸 (图 1a)²。虽然这种策略肯定是有效的, 但其随机的、非特定地点的性质会造成问题。具体而言, 传统的生物共轭方法产生定义差和异质性的免疫共轭, 由成千上万种不同的区域异构体的混合物组成, 每个物质具有自己的生物和药理特性^{集 3}。此外, 如果将货物附加到免疫球蛋白的抗原结合域, 随机生物共轭会阻碍抗体的免疫反应。

多年来, 为解决这些问题, 制定了各种特定地点和场地选择性的生物结合战略^4、5.其中最常见的方法是将含马来酰亚胺探针连接到半胱氨酸的磺基 (图 1b)。igg1 抗体自然含有4个链间二硫基桥, 这些连接可以选择性地减少, 产生自由的硫醇, 能够与马来酰亚胺发生迈克尔加成反应, 形成琥珀酰硫醚键。与传统方法相比, 硫醇和马来酰亚胺的使用无疑是一种改进, 目前有各种各样的含苹果胺的合成器和双功能螯合剂。然而, 必须指出, 这种方法也有严重的局限性。基于马来酰的免疫共轭物在体内表现出有限的稳定性, 因为硫醚链可以经历迈克尔的反应 (图 2)^6,7,8,9,10. 当然, 这可能导致放射性有效载荷的释放或与循环中的带有硫醇的生物分子 (例如谷胱甘肽或血清白蛋白) 的交换。这两种过程都可以增加健康器官中的活性浓度, 并降低目标组织中的活性浓度, 从而降低影像学对比度和治疗率。为了规避这些问题, 开发了几种替代硫醇反应试剂, 包括托基酸盐、溴化和碘乙酰, 以及11、^12、13乙烯基磺酸^.14,15,16,17. 然而, 所有这些办法都有其局限性, 妨碍了其广泛适用。

大约五年前, 斯克里普斯研究所已故卡洛斯·巴巴三世的实验室率先使用苯氧基二唑基甲基磺酸作为试剂, 有选择地与硫醇形成高度稳定的联系 (图1c 和图 3)^18,19. 作者使用了一种含苯氧基甲基磺酸的荧光素变种来修饰几种抗体, 这些抗体设计成含有游离半胱氨酸残基, 最终产生的免疫共轭具有比类似的更高的稳定性。使用基于恶意的探测器创建的构造。看到这项很有前途的工作, 我们感到有些惊讶, 因为这项技术只在放射化学中很少使用, 还没有被用于双功能螯合剂或放射免疫共轭 20^,21的合成.然而, 由于应用不足, 很快就开始变得更加有意义: 几次试图从 sigma-aldrich 采购试剂的努力, 结果收到了复杂的降解产物混合物, 并将所需化合物的 lt;15%。此外, 合成所报告的试剂本身也不是一个现实的选择, 因为公布的合成路线有些繁琐, 需要精密的有机化学设备, 而大多数放射化学和分子成像实验室–包括我们的实验室–根本不拥有。

针对这些障碍, 我们着手创建一种易于获取且高度稳定的苯氧基甲基磺酸试剂, 可通过坚固且合理、简单的合成路线获得。今年早些时候, 我们报告了一种模块化、稳定且易于获得的苯氧基甲基磺酸试剂 (称为 “pods”), 作为基于硫醇的生物共轭平台 (图1c 和图 3)²²。peds 与 barbas 等人报告的试剂之间的主要区别是, 前者使用的是附着在苯氧基磺酸的苯胺环上, 而后者的特点是处于同一位置的苯酚 (图 4)。这一变化促进了更直接、更容易获得的合成路线, 以及–如果我们在商业上可获得的化合物方面的经验具有代表性–更稳定的最终试剂。在这项工作中, 我们还合成了一对含 pods 双功能螯合剂–pods-dfo 和 pods-chx-a ‘-dtpa–分别用于创建⁸⁹zr 标记和¹⁷⁷lu-taid 免疫共轭。正如我们将要讨论的, 我们已经证明, 基于 pod 的位选择生物共轭可重复和强大地创建均匀, 明确的, 高度免疫反应, 和高度稳定的放射免疫共轭。此外, 大肠癌小鼠模型的临床前实验表明, 与通过马来所合成的放射性标记抗体相比, 这些位点选择性标记的放射免疫共轭在体内表现出优越的性能。共轭。

这项工作的首要目标是促进创建定义明确、均匀、高度稳定和高度免疫反应的免疫共轭, 用于体外和体内应用。合成方法很简单, 几乎可以在任何实验室进行, 并且母 pds 试剂可以用大量不同的螯合剂、荧光剂或货物进行改性。在本协议和随附的视频中, 我们将描述简单的四步合成 peds (图 5);创建一个携带 dods 的 dota 变种, 这是一种广泛使用的螯合剂, 用于协调⁶⁴cu、 ⁶⁸ga 、111 in、 ¹⁷⁷lu 和²²⁵ac (图 6);以及 dods-dota 与模型抗体 her2 靶向 igg1 trastuzumab 的生物结合 (图 7)。